Úloha nabitých aminokyselin v první transmembránové doméně lidského P2X7 receptoru

Bc. Olga KLINOVSKÁ

Diplomová práce

The role of charged amino acids in the first transmembrane domain of the P2X7 receptor

Anotace:

Purinergní P2X receptory citlivé k extracelulárnímu ATP jsou po aktivaci schopny tvořit kanály propustné pro ionty. Do skupiny P2X se řadí 7 podjednotek (P2X1-P2X7), přičemž funkční receptor se skládá ze tří podjednotek tvořících homo nebo heteromery. Všechny P2X podjednotky mají podobnou molekulární stavbu tvořenou dvěma transmembránovými doménami, extracelulární doménou a dvěma intracelulárními konci. Tato diplomová práce byla zaměřena na P2X7 receptor, který je exprimován zejména buňkami imunitního systému, kde se účastní imunitních odpovědí makrofágů, lymfocytů, žírných buněk a mikroglií. Krátkodobá aktivace tohoto receptoru vede k vytvoření kanálu propustného pro malé kationty, zatímco při prodloužené aktivaci dochází k vytvoření póru propustného pro molekuly o velikosti až 900 Da. V předchozích experimentech bylo prokázáno, že po záměně nabitých aminokyselin v první transmembránové doméně za alanin dochází k významnému snížení funkce potkaního P2X7 receptoru. Cílem práce bylo zjistit, zda tytéž aminokyseliny hrají roli v procesu aktivace lidského P2X7 receptoru, který se některými vlastnostmi liší od receptoru potkana. Nejdříve byly analyzovány optimální parametry pro fluorimetrické a elektrofyziologické měření funkce lidského P2X7 receptoru. Poté bylo pomocí alaninové mutageneze zjištěno, že mutant lyzinu 30 vykazuje významně sníženou amplitudu agonistou stimulovaného proudu a minimální schopnosti absorpce fluorescenčního barviva ve srovnání s divokým typem receptoru. Nakonec bylo pomocí návratové mutageneze prokázáno, že arginin, ale ne glutamát, v pozici 30 obnovuje normální funkci lidského P2X7 receptoru. Tyto výsledky prokázaly klíčovou roli kladného náboje aminokyseliny v pozici 30 při procesu otevírání iontového kanálu i tvorbě póru lidského P2X7 receptoru, a přispěly k objasnění vztahu mezi molekulární strukturou a funkcí první transmembránové domény tohoto receptoru.

Abstract:

Purinergic P2X receptors represent a novel structural type of ligand-gated ion channels activated by extracellular ATP. The P2X family consists of seven subunits (P2X1-P2X7) while functional receptor is composed of three subunits forming either a homomer or a heteromer. All P2X subunits have similar molecular structure consisting of two transmembrane domains, extracellular domain and two intracellular termini. This thesis is focused on P2X7 receptor, which is highly expressed especially by cells of immune system where it plays a role in immune responses by macrophages, lymphocytes, mast cells and microglia. Short term activation of this receptor leads to formation of ion channel permeable for small cations, while long term activation leads to formation of a large pore permeable for molecules of size up to 900 Da. Previously it has been shown that replacing of charged amino acids in the first transmembrane domain with alanine causes significant disruption of functional properties of the rat P2X7 receptor. The aim of this thesis was to clarify if the same amino acids play a role in the process of activation of human P2X7 receptor that differs in some properties from that of the rat. First, optimal parameters for fluorimetric and electrophysiological measurements of function of human P2X7 receptor have been analyzed. Next, using alanine mutagenesis, it has been found that mutant of lysine 30 exhibits significantly lower amplitude of initial current and lower ability to absorb fluorescent dye compared to wild type receptor after stimulation with agonist. Finally, using rescue mutagenesis, it has been shown that arginine, but not glutmate, at position 30 recovers normal function of human P2X7 receptor. These results revealed a key role of positive charge at position 30 in channel opening and pore formation of human P2X7 receptor and contributed to understanding the relationship between the molecular structure and function of the first transmembrane domain in this receptor.

Klíčová slova

ATP, purinergní signalizace, iontový kanál, lidský P2X7 receptor, první transmembránová doména, mutageneze

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 8. 2020

Zveřejnit od: 31. 12. 2999

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: RNDr. Hana Zemková, CSc.

UNIVERZITA JANA EVANGELISTY PURKYNĚ V ÚSTÍ NAD LABEM

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Biologie