Detekce a kvantifikace máku v potravinách pomocí qPCR

Bc. Sabina Janáková

Master's thesis

Detection and quantification of poppy in food via qPCR

Abstract:

Mák setý (Papaver somniferum L.) je jednoletá rostlina, která je pěstována v České republice jako jedna z nejdůležitějších olejnin. Počátky využití rostliny jsou známy již od 6. tisíciletí před naším letopočtem na území Středozemí. Dnes se jako plodina pěstuje pro potravinářské, farmaceutické a technické účely. Diplomová práce se zaměřuje především na jeho využití v potravinářském odvětví. Cílem práce bylo otestování, zda k detekci a kvantifikaci máku v potravině lze využít genetické markery pro profilování odrůd máku. Analýza potravin bývá znesnadněna faktory, které snižují výtěžnost a kvalitu izolované DNA a tím pádem i dalších analýz. Mezi tyto faktory řadíme přítomnost dalších látek v matrici potraviny (např. polysacharidy, polyfenoly a sekundární metabolity) a vlivy působící na DNA během výrobního procesu. V rámci experimentální části bylo využito několik druhů vzorků: listy mladých rostlin, tepelně ošetřená semena a několik zakoupených potravin. Jednotlivé vzorky byly homogenizovány a rostlinná DNA byla izolována pomocí komerčního kitu DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Německo). Genetické markery byly vybrány ze souboru 27 mikrosatelitů, které byly navrženy v rámci jiné práce na pracovišti Katedry genetiky a šlechtění České zemědělské univerzity. Pro testování bylo vybráno 5 kandidátních markerů: OPTET024b (207-234 bp); OPTET063 (88-108 bp); OPTET065 (224-232 bp), OPTET156 (136-144 bp); OPPEN29 (146-177 bp). Na základě průběhu kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) byly vybrány dva markery s nejvyšší specifitou a odlišnou velikostí amplikonu. Testování probíhalo za použití dvou párů primerů pro každý marker. Následně byly vybrané markery testovány pomocí qPCR s použitím vzorků tepelně ošetřených semen a potravin. Bylo hodnoceno, zda došlo vlivem tepelného ošetření k degradaci DNA a zda je možné tyto markery použít u reálných potravin. Sekvence otestovaných markerů by mohly být využívány v potravinářském průmyslu při detekci a kvantifikaci máku.

Abstract:

The opium poppy (Papaver somniferum L.) belongs to the most important oilseed crops grown in the Czech Republic (it is an annual plant). The plant has been used since the 6th millennium BCE; its origins date back to the Mediterranean. Nowadays, it is cultivated as a crop for food, pharmaceutical and technical purposes. The thesis focuses primarily on its use in the food industry. The thesis sought to investigate whether genetic markers used to profile poppy varieties can be applied to detect and quantify poppy in food. Food analysis is often hampered by factors reducing the yield and quality of the isolated DNA and, therefore, other analyses. These factors include other substances within the food matrix (e. g., polysaccharides, polyphenols, and secondary metabolites) and their effects on the DNA during the production process. Several samples were utilised in the experimental part: food poppy leaves, heat-treated food poppy seeds, and several purchased foodstuffs. Individual samples were homogenised, and the plant DNA was isolated using the commercial DNeasy Plant Mini Kit. Genetic markers were selected from 27 microsatellites designed as part of other work at the Department of genetics and breeding of the Czech University of Life Sciences Prague. Five markers with the highest specificity were selected from the set: OPTET024b (207-234 bp); OPTET063 (88-108 bp); OPTET065 (224-232 bp), OPTET156 (136-144 bp); OPPEN29 (146-177 bp). Two markers with different amplicon magnitudes were selected using real-time quantitative PCR. Marker testing was performed using two primer pairs. Subsequently, the selected markers were tested by qPCR using heat-treated seed and food-specific samples. By comparing amplicon lengths, it was assessed whether the DNA degraded due to heat treatment and whether these markers could be applied to food. The tested marker sequences could be utilised in the food industry to detect and quantify poppy seeds.

Keywords

Papaver Somniferum L., STR mikrosatelity, genetické markery, qPCR, ddPCR

Keywords

Papaver Somniferum L., STR microsatellites, qPCR, ddPCR, genetic markers

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Jakub Vašek, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme:
Food and Nutrition