Targeted editing of the Arabidopsis CYP98A3 gene using the CRISPR/Cas9 method

Bc. Matej Šamaj

Master's thesis

Cílená editace genu CYP98A3 metodou CRISPR/Cas9 u Arabidopsis

Abstract:

Lignin je biopolymer, který plní několik důležitých funkcí včetně usnadnění polárního transportu vody a mechanického zpevnění rostlinného těla. Je nezbytný pro správný růst a vývoj rostlin, ale také pro obranné reakce rostlin. Komplexní biosyntéza ligninu zahrnuje aktivitu mnoha enzymů katalyzujících navazující chemické reakce, které postupně vytvářejí různé prekurzory pro syntézu ligninu. Jeden takový enzym biosyntetické dráhy ligninu, P‐KUMAROYL ŠIKIMÁT 3′‐HYDROXYLÁZA (C3′H), je kódován genem CYP98A3/C3′H a přeměňuje p-kumaroyl šikimát na kafeoyl šikimát. Systémy CRISPR/Cas adaptované z bakterií, kde poskytují adaptivní imunitu, se velmi rychle vyvinuly v jedinečný a výkonný nástroj pro přesnou editaci genů. Technologie CRISPR/Cas9 umožňuje specificky zacílit na požadovaná místa v genomech a následně provést velmi přesnou mutagenezi vybraného genu (genů). Cílem této práce bylo pomocí metody CRISPR/Cas9 provést cílenou editaci genu CYP98A3/C3′H v transformovaných rostlinách Arabidopsis thaliana. Vybrané transformované rostliny byly ověřeny, aby se potvrdila přítomnost úpravy genu zprostředkované CRISPR/Cas9. Ověřená předpokládaná mutantní rostlina T2 generace vykazovala změněné fenotypy listů, listových růžic, stonků a květenství doprovázené nižším ukládáním ligninu, jak bylo zjištěno histochemickým barvením bazickým fuchsinem a mikroskopickými pozorováními.

Abstract:

Lignin is an abundant biopolymer, which fulfils several important functions including facilitation of polar water transport and mechanical strengthening of plant body. It is required for proper growth and development of plants but also for plant defence responses. Complex lignin biosynthesis involves the activity of numerous enzymes catalysing diverse chemical reactions that are stepwise generating various precursors for lignin formation. One such enzyme of lignin biosynthetic pathway, P‐COUMAROYL SHIKIMATE 3′‐HYDROXYLASE (C3′H), is encoded by the gene CYP98A3/ C3′H and convert p-coumaroyl shikimate to caffeoyl shikimate. CRISPR/Cas systems adapted from prokaryotes, where they provide adaptive immunity, have very quickly evolved to unique and powerful tool for precise gene editing. The CRISPR/Cas9 technology allows to specifically target desired sites within the genomes to subsequently perform very precise mutagenesis of selected gene(s). The purpose of this thesis was to employ the CRISPR/Cas9 method to perform targeted editing of the CYP98A3/C3′H gene in transformed Arabidopsis thaliana plants. Selected transformed plants were verified to confirm the presence of CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The verified T2 generation putative mutant plant shows altered phenotypes of leaves, leaf rosettes, stems and inflorescences accompanied by lower deposition of lignin as revealed by histochemical staining by basic fuchsin and microscopic observations.

Keywords

CRISPR/Cas9, lignin, CYP98A3, genová editace, Arabidopsis thaliana, C3′H, histochemie, bazický fuchsin, fenotyp

Keywords

lignin, CYP98A3, gene editing, C3′H, Arabidopsis thaliana, histochemistry, basic fuchsin, CRISPR/Cas9, phenotype

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 4. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 29. 5. 2023
• Supervisor: doc. Mgr. Jan Zouhar, Ph.D.
• Reader: Jan Skalák, externi

Mendel University in Brno

Faculty of AgriSciences

Master programme / specializace:
Molecular Biology and Biotechnology / Plant Molecular Biology and Biotechnology