Multidimensional separation methods in analysis of complex biological mixtures

Mgr. Filip Duša, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Tato práce se zabývá dvoudimenzionálními separacemi peptidů a proteinů obsažených v biologických matricích. Teoretický úvod popisuje extrakci proteinů z biologických matricí, módy izoelektrické fokusace (IEF) a kapalinové chromatografie (LC) používané pro frakcionaci ve dvoudimenzionálních separačních schématech a aktuální články zabývající se kombinací IEF a LC. V části výsledků jsou uvedeny čtyři vědecké články, které prošly připomínkovým řízením a byly publikovány v mezinárodních vědeckých časopisech. V prvním článku bylo testováno zařízení pro IEF v rozbíhavém toku na separaci peptidů pomocí módu autofokusace. Kapilárním formát LC v druhé dimenzi byl následně použit pro separaci frakcí získaných pomocí autofokusace. V následujícím článku bylo popsáno zařízení pro mikropreparativní analýzu pomocí IEF a následně bylo toto zařízení využito pro dvoudimenzionální separaci proteinů a peptidů ze syrovátky. Jednoduchý kapalinový chromatograf využívající tvorbu gradientu mobilní fáze bez dělení průtoku byl popsán ve třetím článku a otestován pro gradientovou eluci v nano objemech. V posledních článku byl popsán zdroj elektrického proudu upravený pro využití při IEF se separačním ložem ve tvaru proužku. V této práci jsem ukázal, že kombinace IEF a LC do dvoudimenzionálních schémat je stále živým tématem a další zlepšování obou metod je přínosné pro separace peptidů a proteinů obsažených v biologických matricích.

Abstract:

This work deals with two-dimensional separations of peptides and proteins from biological matrices. Theoretical introduction describes extraction of proteins from biological matrices, modes of isoelectric focusing (IEF) and liquid chromatography (LC) used for fractionation in two-dimensional separation schemes, and current papers dealing with combination of IEF and LC. In the results chapter there are four papers, which passed reviews and have been published in international scientific journals. In the first paper, divergent-flow IEF was evaluated for separation of peptides in the mode of isoelectric autofocusing. Capillary LC was used as the second dimension to resolve fractions obtained by autofocusing. Furthermore, novel micropreparative IEF device was described and used for two-dimensional separation of proteins and peptides from whey in following article. Simple splitless nano column LC instrument was presented in the third paper and tested for gradient elution in nano volumes. Finally, power supply adapted for strip format of IEF was presented in the last research paper. In this work I have shown that combination of IEF and LC in two-dimensional schemes is still topical and further improvements in both separation techniques are beneficial for separation of proteins and peptides contained in biological mixtures.

Keywords

izoelektrická fokusace, kapalinová chromatografie, dvoudimenzionální separace, úprava vzorku, proteiny, peptidy, syrovátka

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 1. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 29. 1. 2014
• Supervisor: RNDr. Vladislav Kahle, CSc.
• Reader: prof. Mgr. Jan Preisler, Ph.D., doc. Ing. Jan Pospíchal, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biochemistry