Buněčné a molekulární charakteristiky hemolymfy u raků

MSc. NA KIFAYAT ULLAH

Doctoral thesis

The cellular and molecular characteristics of hemolymph in crayfish

Abstract:

The cellular and molecular components of the hemolymph are the major arm of the innate immune system in decapod crustaceans. In-depth knowledge of the hemolymph components, including hemocytes and hemolymph proteins, can enhance our understanding of innate immunity in crustaceans. We utilized transmission electron microscopy and quantitative proteomics to study the cellular and molecular aspects of coagulation and phagocytosis in the hemolymph. Chapter 2 reviews the cellular and molecular parameters of the innate immune system and the effects of environmental stressors and their abiotic and biotic stress mechanisms in decapod crustaceans. The innate immune system of decapod crustaceans heavily relies on hemocytes in the circulating hemolymph. Generally, three types of hemocytes are accepted based on their morphology, however, there is still a lack of consensus among researchers regarding the classification of hemocyte types. The key innate immune functions such as coagulation and phagocytosis are still poorly understood and require further investigation especially at a molecular level. Environmental stressors can adversely affect the immune responses of decapod crustaceans, increasing their susceptibility to diseases. However, the abiotic stress mechanism is poorly understood due to the lack of available literature and needs further investigation. In Chapter 3, transmission electron microscopy was used to investigate the ultrastructural behavior of hemocytes during coagulation and phagocytosis in the early stages of leg amputation injury in marbled crayfish Procambarus virginalis. The granular hemocytes were the first to be activated, and the morphology of cytoplasmic granules changed from electron-dense to electron-lucent forms in an expanding manner. The transformed granules containing amorphous electron-lucent materials merged and discharged their contents into the extracellular space for coagulation. We observed that the leftover nucleus from degranulated hemocytes participates in the process of coagulation, which could be confused with hyalinocytes in some previous studies. In addition, leg amputation caused massive muscle degeneration, followed by a significant influx of phagocytic hemocytes that removed a substantial amount of muscle fibers and organelles, such as mitochondria, generated from disintegrating and decaying muscle. Furthermore, we found that phagocytic hemocytes contained varying numbers of granules in their cytoplasm and, for the first time, discovered that these cells incorporate necrotic bodies resulting from degenerated muscles into their organelles, such as cytoplasmic granules and nucleus. The granular hemocytes were found to be the main cells that carry out phagocytic activity in the injury site. This study provides a comprehensive description of all the stages of morphological changes in hemocytes during coagulation and phagocytosis after injury in crayfish for the first time. In Chapter 4, proteomic analysis of non-clotted and clotted samples indicated that quantities of most proteins remained unchanged during the coagulation process, suggesting that necessary proteins for coagulation are pre-synthesized and stored before clot formation. Due to their open circulatory system, decapod crustaceans possess robust clotting mechanisms. Upon injury, pre-synthesized clotting factors are released, resulting in clot formation. Therefore, only a few proteins, such as C-type lectin domain-containing proteins, Laminin A chain, and Tropomyosin, were down-regulated during clotting, suggesting their possible roles in the structural integrity of cells. Their downregulation could facilitate degranulation, a crucial step for clot formation.

Abstract:

Celulární a molekulární složky hemolymfy jsou hlavní součástí vrozeného imunitního systému u desetinožců. Hlubší znalosti složek hemolymfy, včetně hemocytů a proteinů hemolymfy, mohou zlepšit naše chápání vrozené imunity u korýšů. Pro studium celulárních a molekulárních aspektů koagulace a fagocytózy jsme využili transmisní elektronovou mikroskopii a kvantitativní proteomiku. Kapitola 2 přehledně shrnuje celulární a molekulární parametry vrozeného imunitního systému a účinky environmentálních stresorů a jejich abiotických a biotických stresových mechanismů u desetinožců. Vrozený imunitní systém desetinožců se silně opírá o hemocyty. Obecně jsou přijímány tři typy hemocytů na základě jejich morfologie, avšak stále existuje nedostatek shody ohledně klasifikace typů hemocytů. Klíčové funkce vrozené imunity, jako jsou koagulace a fagocytóza, jsou stále špatně pochopeny a vyžadují další zkoumání zejména na molekulární úrovni. Environmentální stresory mohou negativně ovlivnit imunitní odpovědi desetinožců, čímž zvyšují jejich náchylnost k nemocem. Avšak abiotický stresový mechanismus je špatně pochopen kvůli nedostatku dostupné literatury a vyžaduje další zkoumání. V kapitole 3 byla transmisní elektronová mikroskopie použita k prozkoumání ultrastrukturního chování hemocytů během koagulace a fagocytózy v raných stadiích zranění amputace nohy u raka mramorovaného Procambarus virginalis. Granulární hemocyty byly aktivovány jako první a morfologie cytoplazmatických granulí se změnila z elektronově hustých na elektronově průsvitné formy v expanzivním způsobu. Transformované granule obsahující amorfní elektronově průsvitné materiály se sloučily a vypustily svůj obsah do extracelulárního prostoru pro koagulaci. Pozorovali jsme, že zbývající jádro z degranulovaných hemocytů se podílí na procesu koagulace, což by mohlo být v některých předchozích studiích zaměněno s hyalinocyty. Kromě toho amputace nohy způsobila masivní degeneraci svalů, následovanou významným přílivem fagocytických hemocytů, které odstranily značné množství svalových vláken a organel, jako jsou mitochondrie, generované z rozpadajících se a rozkládajících se svalů. Dále jsme zjistili, že fagocytické hemocyty obsahují různé počty granulí v cytoplazmě a poprvé jsme objevili, že tyto buňky začleňují nekrotická tělíska vzniklá z degenerovaných svalů do svých organel, jako jsou cytoplazmatické granule a jádro. Granulární hemocyty byly nalezeny jako hlavní buňky provádějící fagocytickou aktivitu na místě zranění. Tato studie poskytuje poprvé komplexní popis všech stadií morfologických změn hemocytů během koagulace a fagocytózy po zranění u raků. V kapitole 4 proteomická analýza sražených a nesražených vzorků ukázala, že množství většiny proteinů zůstalo během koagulačního procesu nezměněno, což naznačuje, že nezbytné proteiny pro koagulaci jsou předem syntetizovány a uloženy před vznikem sraženiny. Díky svému otevřenému oběhovému systému mají desetinožci robustní koagulační mechanismy. Po zranění jsou uvolněny předem syntetizované koagulační faktory, což vede ke vzniku sraženiny. Proto byly pouze některé proteiny, jako jsou proteiny obsahující domény C-typu lektinu, laminin A řetězec a tropomyosin, během srážení sníženy, což naznačuje jejich možné role ve strukturní integritě buněk. Jejich snížení by mohlo usnadnit degranulaci, klíčový krok pro vznik sraženiny.

Keywords

Vrozená imunita, Srážení hemolymfy, Fagocytóza, Proteomika krevních sraženin

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 28. 8. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: MSc. Hamid Niksirat Hashjin, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / odbor:
Zootechnics / Fishery