Characterization of RanGTPase pathway proteins in plants

Mgr. Eva TOMAŠTÍKOVÁ, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Přesné rozdělení genetické informace a tudíž i kompletní sady genů do dceřiných buněk jsou klíčovými událostmi buněčného cyklu. Transport regulačních proteinů mezi jádrem a cytoplazmou v interfázních buňkách reguluje správné načasování jednotlivých fází buněčného cyklu. Samotná segregace chromozomů je pak zprostředkována mitotickým vřeténkem, strukturou z mikrotubulů, která se vytváří během mitózy ve všech eukaryotických buňkách. RanGTPázová dráha je jedna z nejdůležitějších regulačních drah nezbytná pro život buňky, zapojená v regulaci transportu proteinů mezi jádrem a cytoplazmou, stejně jako v tvorbě mitotického vřeténka. Komponenty RanGTPázové dráhy jsou již poměrně dobře charakterizovány u živočišných buněk, nicméně jejich znalost u rostlin je limitována. Tato dizertační práce popisuje neznámé nebo málo charakterizované proteiny RanGTPázové dráhy u modelové rostliny huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana). První protein, kterým se tato dizertační práce zabývá je protein RanBPM. Poprvé byl popsán v lidských buňkách, kde byl lokalizován v centrosomech, tj. místech zodpovědných za organizaci mikrotubulárního cytoskeletu u živočichů. Protein se podílí na procesu nukleace mikrotubulů a byla prokázána jeho interakce s regulačním proteinem Ran. Na základě podobnosti sekvencí byl charakterizován jeho homolog u Arabidopsis, AtRanBPM. Sekvence byla klonována do binárního vektoru a lokalizace proteinu byla studována pomocí biochemických technik a mikroskopie. Navzdory podobnosti s živočišným proteinem, AtRanBPM je během interfáze lokalizován v jádře a cytoplasmě, a v mitóze signál zcela mizí. Protein je součástí vysokomolekulárních proteinových komplexů, nicméně nebyla prokázána jeho interakce s proteinem Ran. Rostlinný homolog proteinu RanBPM zřejmě plní jinou roli než účast v RanGTPázové dráze, pravděpodobně regulaci degradace proteinů. Klíčovým faktorem zapojeným do tvorby mitotického vřeténka, který je regulovaný RanGTPázovou dráhu, je protein TPX2. Podobně jako jeho živočišný homolog je AtTPX2 lokalizován s mikrotubuly mitotického vřeténka, nicméně jeho přesná funkce u rostlin není známá. Pro objasnění jeho funkce v rostlinných buňkách, byl AtTPX2 nadprodukován v buňkách huseníčku, kde byl lokalizován se svazky mikrotubulů okolo jaderné membrány a jádra. Kolokalizační a kopurifikační studie prokázaly interakci AtTPX2 s importinem a také s proteinem Ran. Tato zjištění naznačují roli proteinu TPX2 v tvorbě mitotického vřeténka v blízkosti chromozomů regulovaného RanGTPázovou dráhou také u acentrozomálních rostlinných buněk. Lidský homolog TPX2 je aktivátorem Aurora kinázy A, mitotické kinázy nezbytné pro tvorbu mitotického vřeténka a průchod buněčným cyklem. Bylo prokázáno, že AtTPX2 je v průběhu buněčného cyklu lokalizován s AtAurora1, homologem Aurora kinázy A u huseníčku. Pro potvrzení přítomnosti podobného mechanismu i u rostlin byly připraveny rekombinantní proteiny AtTPX2 a AtAurora1 v bakteriích Escherichia coli. Bylo zjištěno, že AtTPX2 je fosforylován kinázou AtAurora1 in vitro. AtTPX2 významně zvyšoval autofosforylační aktivitu Aurora kinázy, která vedla ke zvýšené fosforylaci histonu H3, důležitého substrátu této kinázy. Tyto výsledky naznačují, že aktivace AtAurora1 pomocí AtTPX2 může být důležitým mechanismem pro přenos RanGTP signalizace na fosforylační kaskádu zprostředkovanou Aurora kinázami. Výsledky publikované v této práci objasňují proces nukleace mikrotubulů v blízkosti chromatinu u acentrozomálních rostlinných buněk regulovaný proteinem AtTPX2. AtTPX2 byl charakterizován jako aktivátor AtAurora1, mitotické kinázy zapojené v segregaci chromozomů a průchod buňky buněčným c

Abstract:

Accurate segregation of genetic information and therefore complete set of genes to daughter nuclei is one of the key events in cell cycle. Proper timing of cell cycle events is regulated during interphase by nucleocytoplasmic transport of regulatory proteins. During mitosis, chromosome segregation is mediated by mitotic spindle, a microtubular structure present in all eukaryotic cells. RanGTPase pathway is one of the most important signaling pathways involved in the control of nucleocytoplasmic transport and mitotic spindle assembly. Although the regulators of RanGTPase pathway have been well characterized in animals, the information in plants is limited. In order to clarify these processes in plants, I have investigated new and poorly characterized proteins regulated by RanGTPase pathway in a model plant Arabidopsis thaliana. Homologue of human Ran-binding protein in microtubule-organizing center, RanBPM was identified in Arabidopsis. AtRanBPM was cloned to binary vectors and localization of the protein was analyzed using both microscopical techniques and biochemical techniques. In contrast to human homologue, AtRanBPM protein is localized in nucleus and cytoplasm of interphase cells and is depleted during mitosis. Furthermore, AtRanBPM is present in high molecular weight complexes. RanGTP was not observed among interactors of AtRanBPM. Therefore the involvement of AtRanBPM in RanGTPase pathway is unlikely and probably plays another role, most likely in regulation of protein degradation. Targeting protein for Xklp2 (TPX2) is key factor involved in mitotic spindle assembly regulated by RanGTPase pathway. AtTPX2 is localized with spindle microtubules similarly to its animal homologues; however, its exact function is unknown. To elucidate the process of microtubule nucleation in acentrosomal plant cells in more detail, AtTPX2 was overexpressed in Arabidopsis cells. In AtTPX2 overexpressing cells, the protein decorated microtubule bundles formed in the vicinity of nuclear envelope and in the nuclei. Moreover, colocalization and co-purification experiments provided an evidence for interaction of AtTPX2 and importin and Ran, respectively. This suggests that AtTPX2 is involved in chromatin-induced microtubule formation regulated by RanGTPase pathway also in acentrosomal plant cells. It was shown that AtTPX2 colocalizes with AtAurora1, Arabidopsis homologue of Aurora kinase A, in cell-cycle specific manner. Human TPX2 is an activator of Aurora kinase A, a mitotic kinase required for spindle formation and cell cycle progression. To prove whether similar regulatory mechanism exists also in plants, AtTPX2 and AtAurora1 were expressed in bacteria and purified. It was shown that AtTPX2 acts as a substrate for AtAurora1. AtTPX2 was not only the substrate, but also significantly increased autophosphorylation activity of the kinase. Moreover, the increased AtAurora1 activity resulted in increased phosphorylation of histone H3, the important downstream target of AtAurora1. Activation of AtAurora1 by AtTPX2 could be a mechanism for translation of RanGTP signaling to phosphorylation cascade performed by Aurora kinases. Altogether, our findings elucidated the process of chromatin-induced microtubule nucleation in acentrosomal plant cells regulated by AtTPX2. Furthermore, AtTPX2 was found to be the activator of AtAurora1, the mitotic kinase involved chromosome segregation and cell cycle progression. The results suggest that AtTPX2 together with AtAurora1 might be involved in proper chromosome segregation during mitosis. Taken together, our findings help to elucidate complicated and still not fully understood phenomenon of chromosome segregation and cell cycle regulation, the key events in cell life.

Abstract:

yklem. AtTPX2 by tedy mohl být společně s kinázou AtAurora1 zapojen v segregaci chromozomů během mitózy. Naše výsledky pomáhají objasnit komplikovanou a stále ne plně objasněnou problematiku segregace chromozomů a regulace buněčného cyklu, klíčové procesy buněčného cyklu.

Keywords

RanGTPázová dráha, buněčné jádro, mitotické vřeténko, buněčné dělení, rostlina

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 7. 2014

Accessible from:: 17. 7. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 16. 9. 2014
• Supervisor: prof. Ing. Jaroslav Doležel, DrSc.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology / Botany