Studium enzymů a buněk imobilizovaných na magnetických nosičích a jejich aplikace

Mgr. Kristýna POSPÍŠKOVÁ

Disertační práce

Study of enzymes and cells immobilized on magnetic carriers and their applications

Anotace:

Cílem teoretické části disertační práce bylo vypracování přehledné literární rešerše zabývající se problematikou imobilizace enzymů a buněk na magnetické nosiče. Pozornost byla zaměřena na význam procesu imobilizace enzymů, dále na základní způsoby imobilizace a jejich aplikační možnosti. Byly také popsány základní metody syntézy magnetických materiálů a rozebrány možnosti přípravy magnetických materiálů z nemagnetických prekurzorů. Byl zpracován přehled různých možností funkcionalizace magnetických materiálů a jejich následné aktivace před imobilizačním procesem. Aplikační potenciál enzymů imobilizovaných na magnetických materiálech byl demonstrován rozsáhlou tabulkou. V další části byly shrnuty základní poznatky o imobilizaci buněk na magnetické materiály nebo jejich magnetické modifikaci. Přiložené tři přehledné články jsou zaměřeny na přípravu magnetických (nano)biokompositů a jejich využití, dále na magnetické techniky pro detekci a stanovení xenobiotik a buněk ve vodných vzorcích a na magnetické uhlí pro bio- a environmentální aplikace. Experimentální část práce se věnuje vývoji nových postupů pro přípravu magnetických nosičů vhodných pro imobilizaci enzymů (např. jednokroková modifikace magnetickou kapalinou, využití mikrovlnného záření nebo mechanochemická syntéza). Důraz je kladen především na jednoduchost, rychlost a nízké finanční náklady postupů a použitých materiálů. Různé typy těchto magnetických nosičů (např. minerální práškové, celulosové, přírodní lignocelulosové, biopolymerní chitosanové a ionexové) byly následně využity pro imobilizaci vybraných průmyslově významných hydrolas, zejména lipasy z Candida rugosa, beta-galaktosidasy neboli laktasy z Kluyveromyces lactis nebo trypsinu z hovězího pankreatu. Pro imobilizace byly využity různé fyzikální postupy nebo chemické metody s pomocí imobilizačních činidel. Byla posuzována zvláště stabilita různých typů vazeb imobilizovaných enzymů na těchto magnetických nosičích. Jako ukázka praktické aplikace byly magnetické materiály využity např. při konstrukci optického biosensoru s imobilizovanou diaminooxidasou z Pisum sativum pro stanovení biogenních aminů nebo pro jednokrokovou izolaci chitinasy ze surového latexu Euphorbia characias. Byla taktéž studována jednokroková magnetická modifikace kvasinkových buněk Saccharomyces cerevisiae pomocí mikročástic oxidů železa nebo magnetického chitosanu syntetizovaných za účasti mikrovlnného záření. Byly prokázány i možné katalytické ?peroxidasové? schopnosti biomolekuly magnetoferritinu, v jejíž proteinové struktuře jsou přítomny magnetické nanočástice oxidů železa. Předložená práce tedy prezentuje nové postupy pro přípravu magnetických nosičů vhodných pro imobilizaci enzymů a buněk. Přináší inspiraci pro přípravu celé řady dalších magnetických materiálů. Materiály tohoto typu jsou zvláště výhodné pro aplikace ve větším měřítku z důvodu jednoduchosti a finanční nenáročnosti přípravy. Magnetické vlastnosti navíc umožňují jejich rychlou a snadnou separaci i ze složitějších směsí pomocí vnějšího magnetického pole s využitím magnetických separátorů. Magnetické materiály a techniky proto tvoří velmi významný prvek zejména pro biotechnologické a environmentální aplikace.

Abstract:

The theoretical part of this doctoral thesis was focused on literature overview dealing with immobilization of enzymes and cells on magnetic carriers. Attention was focused on the importance of the process of enzyme immobilization, as well as the basic methods of immobilization and their application possibilities. The general techniques of magnetic materials synthesis were also described and the methods of magnetic materials preparation from non-magnetic precursors were discussed. Various options of functionalization of magnetic materials and their subsequent activation before immobilization process were described. Application potential of enzymes immobilized on magnetic materials was demonstrated in the table. The next section summarizes the basic information about immobilization of cells on magnetic materials or magnetic modification of cells. Attached three review articles are focused on the preparation of magnetic (nano)biocomposites and their applications, as well as on the magnetic techniques for the detection and determination of xenobiotics and cells in water samples and on the magnetically responsive activated carbons for bio- and environmental applications. The experimental part of the thesis deals with the development of new processes for the preparation of magnetic carriers suitable for the immobilization of enzymes (e.g., one-step modification using magnetic fluid, the use of microwave irradiation or mechanochemical synthesis). Emphasis is placed on simplicity, speed and low cost of processes and materials used. Various types of these magnetic carriers (such as mineral powder, cellulose, natural lignocellulose, biopolymer chitosan and ion exchangers) were subsequently used for the immobilization of selected industrially important hydrolases, especially lipase from Candida rugosa, beta-galactosidase (lactase) from Kluyveromyces lactis or trypsin from bovine pancreas. Various physical processes or chemical methods using immobilization agents were used for the immobilization. Particularly stability of different types of bonds between immobilized enzymes and magnetic carriers was considered. As an example of the practical application, magnetic materials were used in the construction of an optical biosensor with immobilized diamine oxidase from Pisum sativum for the determination of biogenic amines or for the one-step isolation of chitinase from raw latex of Euphorbia characias. One step magnetic modification of Saccharomyces cerevisiae yeast cells by microwave-synthesized iron oxides or magnetic chitosan microparticles was also studied. Possible catalytic peroxidase-like activity of magnetoferritin biomolecule containing magnetic iron oxides nanoparticles in its protein structure was demonstrated. This thesis therefore introduces the new procedures for the preparation of magnetic carriers suitable for the immobilization of enzymes and cells. It brings inspiration for the preparation of a large number of other magnetic materials. Materials of this type are particularly advantageous for the large scale applications due to the simplicity and cost efficiency of preparation. Their magnetic properties also enable quick and easy separation of magnetic materials even from complex mixtures using external magnetic field generated by magnetic separators. Magnetic materials and techniques therefore constitute a very important element especially for biotechnological and environmental applications.

Klíčová slova

imobilizace enzymů a buněk, magnetická modifikace buněk, magnetické celobuněčné biokatalyzátory, magnetické nosiče, magnetická modifikace materiálů, (nano)biokomposity, magnetická separace, magnetická izolace, biosensor, lipasa, laktasa

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 7. 2013

Zveřejnit od: 31. 12. 2999

Obhajoba závěrečné práce

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie