Funkce cyklin-dependentních kináz 12 a 13 ve vývoji myši

Mgr. Monika Nováková, Ph.D.

Doctoral thesis

Function of cyclin-dependent kinases 12 and 13 during mouse development

Anotácia:

Proces genové exprese je primárně řízen na úrovni transkripce specifických mRNA za účasti RNA polymerázy II (RNAPII), jejíž aktivita je pod kontrolou rodiny cyklin-dependentních kináz (CDKs). V nedávné době byly identifikovány CDK12 a CDK13 jako nové proteinové kinázy podílející se na regulaci aktivity RNAPII, které tvoří v buňce rozdílné katalyticky aktivní komplexy s cyklinem K (CYCK). U myší deficientních pro CYCK nebo CDK12 byla pozorována embryonální letalita během přechodu z moruly do blastocysty, nicméně funkce CDK13 ve vývoji organismu zatím nebyla studována. Naším hlavním cílem bylo sledování ztráty funkce CDK13 na celkový vývoj organismu na modelu knock-out myši. Byla prokázána embryonální letalita Cdk13 knock-out (Cdk13ko) myší do 16,5 dne po oplození (E16,5) spojená s nesprávným nebo opožděným vývojem celé řady orgánů, a to jmenovitě srdce, ledvin, mozku anebo vývoje obličeje, projevujícím se rozštěpem patra až frontonazální dysplázií. Příčinou letality v tomto stádiu bylo pravděpodobně srdeční selhání doprovázené nedostatečným krevním zásobením poškozených orgánů. Pozorovaný fenotyp Cdk13ko myší odpovídal částečně defektům pozorovaným u pacientů s heterozygotními mutacemi CDK13 genu, které byly nedávno popsány jako nový vývojový syndrom u člověka charakteristický kongenitálními srdečními vadami, dysmorfními znaky obličeje a poškozením intelektuálního vývoje (CHDFIDD). Jsme přesvědčeni, že námi vyvinutý myší model Cdk13 je vhodným experimentálním systémem pro studium vývojových procesů a molekulárních mechanismů, které jsou poškozeny v důsledku mutace genu pro CDK13 u pacientů s CHDFIDD syndromem. Analýza transkriptomu a následná qPCR odhalila CDK13-dependentní geny Reln, Rnf157, Slc2a13, Gpr137c, Bend6 a Zmat1 jako signifikantně snížené v srdci Cdk13ko myší stádia E12,5. Pokles hladiny RELN a RNF157 byl rovněž detekován společně s poklesem p35 a pSAPK/JNK v embryonálním mozku Cdk13ko myší. Navíc migrační analýza prokázala zvýšenou rychlost migrace a sníženou rychlost adheze a proliferace Cdk13ko myších embryonálních fibroblastů (MEFs). Uvedené výsledky naznačují zapojení CDK13 do procesů vývoje mozkové kůry a její důležitost pro migraci buněk při formování embryonálních orgánů. V neposlední řadě jsme se zaměřili na popis funkce CDK12 ve vývoji mléčné žlázy na modelu Cdk12 heterozygotní (Cdk12het) myši. U těchto myší byla prokázána signifikantní poporodní mortalita mláďat způsobená poškozenou laktací z důvodu narušené terminální diferenciace epiteliálních buněk mléčné žlázy, podpořené výsledky z ex vivo organoidových experimentů. Současně bylo u Cdk12het myší po porodu dokumentováno snížené množství epitelu produkujícího mléko. Tato poškození byla navíc spojena s narušením prolaktinové hormonální signalizace. Naše výsledky tedy představují dvojí vliv deficitu CDK12 na vývoj mléčné žlázy myši v těhotenství a laktaci – systémový a epitelově-specifický. Tato nově popsaná fyziologická role CDK12 v laktogenní diferenciaci mléčné žlázy může sloužit nejen pro podrobnější studium daného tématu, ale také pro popis kancerogeneze závislé na CDK12 signalizaci.

Abstract:

Gene expression is executed primarily at the level of transcription of specific mRNAs by RNA polymerase II (RNAPII); its activity is mediated by phosphorylation of a family of cyclin-dependent kinases (CDKs). Recently, CDK12 and CDK13 were identified as novel CDKs regulating activity of RNAPII, which in association with cyclin K (CYCK) form two mutually exclusive catalytically active complexes in cells. Generation of knock-out mice for CYCK and CDK12 led to developmental lethality during morula-blastocyst transition, yet the impact of CDK13 loss-of-function during mammalian development has been unknown. In this thesis, we aim to describe the effect of CDK13 loss-of-function in embryonic development using Cdk13 knock-out (Cdk13ko) mouse model. We observed embryonic lethality of Cdk13ko animals by the embryonic day 16.5 (E16.5) accompanied by improper development of multiple organs, such as heart, kidney, brain and craniofacial development including palate formation to frontonasal dysplasia. The lethality at this stage is a result of heart failure most likely due to multiple heart defects followed by insufficient blood circulation resulting in multiple organs dysfunctions. Cdk13ko mouse phenotype resembled partly phenotype of human patients with heterozygous variants of CDK13 recently described as a new congenital heart defects, dysmorphic facial features and intellectual developmental disorders (CHDFIDD) syndrome in humans. We are convinced that our Cdk13ko mice might be a very useful model for further studies focused on delineating molecular mechanisms underlying CHDFIDD caused by mutation in CDK13 gene. Transcriptome analysis and qPCR have unveiled CDK13-dependent genes Reln, Rnf157, Slc2a13, Gpr137c, Bend6 and Zmat1 significantly decreased in Cdk13ko hearts in E12.5 embryos. Reduced amounts of RELN, RNF157, p35 and pSAPK/JNK have been detected in embryonic Cdk13ko brains as well. Moreover, migration experiments have revealed increased rate of migration and decreased level of adhesion and proliferation of Cdk13ko mouse embryonic fibroblasts (MEFs). These results suggest the involvement of CDK13 in the processes of cortical development and cell migration during organogenesis. Last, but not least, we focused on the function of CDK12 in mammary gland development using Cdk12 heterozygous (Cdk12het) mouse model. These mice exhibit significant postnatal mortality of newborn pups caused by impaired lactation due to disrupted terminal differentiation of mammary epithelial cells, supported by results from organoid experiments. This defect has been further pronounced by reduced amount of lactating epithelium and disruption of prolactin hormonal signaling in Cdk12het mice. Taken together, we reveal both systemic and epithelial-intrinsic effect of CDK12 deficiency in pregnancy and lactation. This newly described physiological function of CDK12 in lactogenic differentiation might trigger further studies not only in this field, but also for cancer studies depending on CDK12 signaling.

Kľúčové slová

Cyklin-dependentní kináza 12, Cyklin-dependentní kináza 13, Cyklin K, Regulace transkripce, Embryonální vývoj, Myš, CHDFIDD syndrom, Mléčná žláza, Laktace, Cyclin-dependent kinase 12, Cyclin-dependent kinase 13, Cyclin K, Transcription regulation, Embryonic development, Mouse, Mammary gland, Lactation

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 2. 9. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 30. 10. 2020
• Vedúci: Mgr. Jiří Kohoutek, Ph.D.
• Oponent: Ing. Andrej Šušor, Ph.D., Ing. Jan Verner, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Molecular and Cell Biology and Genetics / Molecular and Cell Biology and Genetics