Možnosti využití molekulárně biologických metod pro časnou diagnostiku oportunních infekcí u hematoonkologických nemocných

Mgr. Dita Říčná, Ph.D.

Doctoral thesis

Early diagnosis of opportunistic infections in hematooncological patients by molecular biology methods

Anotácia:

Velmi závažnou, život ohrožující komplikací léčby nemocných s hematologickou malignitou je rozvoj infekcí způsobených oportunními mikroorganismy. Úspěšnost léčby oportunních infekcí závisí hlavně na rychlé diagnostice a možnosti okamžitého zahájení cílené terapie. Hlavní původce lze rozdělit na bakteriální, virové a mykotické, jejichž molekulárně biologická diagnostika je předmětem této dizertační práce. V posledních letech se incidence invazivních mykotických infekcí (IMI) zvyšuje a také se mění druhové zastoupení mykotických patogenů. Zatímco dříve mezi původci dominovaly vláknité houby rodu Aspergillus a kvasinky rodu Candida, v posledních letech se stále častěji setkáváme s infekcemi vyvolanými tzv. vzácnými druhy vláknitých hub, které jsou často primárně rezistentní k některým skupinám antimykotik a vyžadují specifickou antimykotickou léčbu. Diagnostika IMI je v současné době založena na kombinaci klinických příznaků, radiologického nálezu a výsledků mikrobiologických vyšetření. Vývoj metod molekulární biologie představuje do budoucna velký příslib, a to zejména z důvodu urychlení a zpřesnění diagnostiky IMI. U hematoonkologických pacientů je výsledek kultivace většinou negativní a tak vhodně zvolené metody založené na PCR představují jedinou možnost identifikace patogena do rodu či druhu a zvolení cílené antimykotické léčby. Cílem předkládané dizertační práce bylo zaměřit se na diagnostiku vzácných mykóz, vytvořit přehled o nejčastějších původcích IMI a popsat možnosti jejich detekce pomocí molekulárně biologických metod. Do rutinní diagnostické praxe byla na našem pracovišti zavedena PCR metodika pro detekci nejvýznamějších mukormycet a screeningová metoda panfungální PCR s následnou HRM analýzou, která umožňuje odlišit původce infekce od kolonizující/kontaminující mikroflóry a má velký přínos zejména v případě vzácných mykóz. Dále byly popsány kazuistiky dvou případů vzácné IMI u hematoonkologických pacientů k jejichž diagnostice přispěla panfungální PCR ze sterilních tkání. Dále byl zhodnocen přínos metody panfungální PCR u nesterilních klinických vzorků jako je tekutina z bronchoalveolární laváže (BAL). Studie ukázala, že panfungální PCR není vhodná pro rutinní diagnostické využití a to zejména pro svou časovou náročnost a nejednoznačné výsledky. Zavedené metodiky významně urychlily a zkvalitnily diagnostiku IMI v laboratořích Centra molekulární biologie a genové terapie při Interní hematologické a onkologické klinice Fakultní nemocnice Brno a přispěly ke zlepšení prognózy imunokompromitovaných pacientů. Výsledky práce byly prezentovány na mnoha českých i zahraničních konferencích a publikovány v impaktovaných časopisech. Tato práce je komentovaným souborem publikací doktoranda.

Abstract:

A serious, life-threatening complication in the treatment of patients with haematological malignancies is the development of infections caused by opportunistic microorganisms. The success of managing opportunistic infections depends on the early diagnostics and prompt initiation of targeted antifungal therapy. The main causatives can be divided into three groups - bacterial, viral and mycotic pathogens, the laboratory diagnostics of mycotic pathogens, is the subject of this dissertation. In recent years, the incidence of IMI has been increasing and we also observe a change in the spectrum of causative fungal species. The vast majority of invasive mycotic infections (IMI) events are still caused by the genera Candida and Aspergillus, however, more cases caused by previously uncommon fungal genera, which are often primarily resistant to certain groups of antifungals, have been reported over the past decades. The diagnostics of IMI is currently based on a combination of clinical signs, radiological findings and microbiology test results. The development of molecular methods is very promising, particularly to speed up and refine IMI diagnostics. In haematological patients, the result of cultivation is relatively often negative, so PCR-based methods represent the only possibility to identify a pathogen in a genus or species and to choose targeted antimycotic treatments. The goal of this thesis was to focus on the diagnosis of rare mycoses, to create an overview of the most common etiological agents and to describe the possibilities of their detection using molecular biology methods. We have introduced PCR to detect the most important mucormycetes and a panfungal PCR screening method, followed by HRM analysis, which makes it possible to distinguish an ongoing infection from the colonizing/ contaminating microflora and has been very helpful, especially in cases of rare mycosis, into routine diagnostic practice. In addition, two case reports of rare IMI have been described in haematological patients, where panfungal PCR from sterile tissue has been used for diagnostics. Furthermore, the benefit of the panfungal PCR method was evaluated in non-sterile clinical specimens such as bronchoalveolar lavage fluid (BAL). The study has shown that panfungal PCR is not suitable for routine diagnostic use, especially for its time consuming and ambiguous results. This work has made an important contribution to enhancing diagnostics of IMI in the Centre of Molecular Biology and Gene Therapy (Department of Internal Medicine – Haematooncology, University Hospital Brno and Masaryk University) and has contributed to improving the prognosis in immunocompromised patients. The results of this work have been presented at many Czech and international meetings and have been published in international journals with impact factor. This work is a commented set of student's publications.

Kľúčové slová

Invazivní mykotické infekce, molekulárně biologická diagnostika, panfungální PCR, oblast ITS, tekutina z bronchoalveolární laváže, mykotické patogeny, imunokompromitovaní pacienti

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 31. 8. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 21. 5. 2019
• Vedúci: doc. Mgr. Martina Lengerová, Ph.D.
• Oponent: MUDr. Peter Múdry, Ph.D., doc. MUDr. Pavel Žák, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / odbor:
Oncology (4-years) / Oncology