Vliv astrocytů a gliových buněk na výsev tau-proteinu ve 2D a 3D kulturách

Bc. Ihor KOZLOV

Master's thesis

Effect of astrocytes and glial cells on tau seeding in 3D cultures.

Abstract:

Due to the growing number of patients with various forms of dementia associated with tau pathologies, choosing a reliable model for studying the mechanisms of tau sorting, seeding and the formation of pathological protein aggregates is essential. Therefore, developing trustworthy tauopathy in vitro models is crucial for further fundamental and pharmacological research. The conditions for cultivating the neuroblastoma cell line were compared in the thesis, and the possibility of performing the tau seeding assays in two-dimensional and three-dimensional versions was explored. It was shown that SH-SY5Y differentiated with RA and BDNF are suitable for research of TAU sorting and seeding with R3 aggregates. Differentiated cells also showed a significant increase in the production of Choline Acetyltransferase, which indicates the direction of their development in favor of cholinergic neurons. A cell line miming astrocytes (SNB-75) was chosen due to the expression of the glial fibrillary acidic protein. It can be cultured simultaneously with SH-SY5Y. The protocol for their differentiation in co-culture was also established. SNB-75 cells demonstrated the ability to influence tau seeding. The seeding activities in mono- and co-cultures were observed using fluorescent microscopy. The differentiation was controlled by morphology analysis and western blotting. The cell lines are characterized by a comparatively low cost of cultivation, the ease of genetic modification, the possibility of differentiation and the formation of spheroids. They may be of interest as a basis for creating a three-dimensional model of the co-culture of cells with the properties of astrocytes and neurons, which can reflect the conditions for the initial stage of tauopathy with a minimum of time and financial resources spent.

Abstract:

Vzhledem k rostoucímu počtu pacientů s různými formami demence spojenými s patologií tau je zásadní zvolit spolehlivý model pro studium mechanismů třídění, výsevu a tvorby patologických proteinových agregátů tau. Vývoj důvěryhodných modelů tauopatie in vitro je proto zásadní pro další základní a farmakologický výzkum. V práci byly porovnány podmínky kultivace neuroblastomové buněčné linie a byla prozkoumána možnost provádění testů tau výsevu ve dvojrozměrné a trojrozměrné buněčné kultuře. Ukázalo se, že SH-SY5Y diferencované pomocí RA a BDNF jsou vhodné pro výzkum třídění TAU a výsevu R3 agregátů. Diferencované buňky také vykazovaly významné zvýšení produkce cholin acetyltransferázy, což naznačuje směr jejich vývoje ve prospěch cholinergních neuronů. Buněčná linie napodobující astrocyty (SNB-75) byla vybrána kvůli expresi gliálního fibrilárního kyselého proteinu. Bylo prokázáno, že ji můžeme kultivovat současně s SH-SY5Y. Byl rovněž stanoven protokol pro jejich diferenciaci ve společné kultuře. Buňky SNB-75 prokázaly schopnost ovlivňovat výsev tau. Aktivita výsevu v monokultuře a v kokultuře byla pozorována pomocí fluorescenční mikroskopie. Diferenciace byla kontrolována morfologickou analýzou a western blottingem. Buněčné linie se vyznačují relativně nízkými náklady na kultivaci, snadnou genetickou modifikací, možností diferenciace a tvorby sféroidů. Mohou být zajímavé jako základ pro vytvoření trojrozměrného modelu společné kultivace buněk s vlastnostmi astrocytů a neuronů, který může odrážet podmínky počátečního stadia tauopatie s minimem vynaložených časových a finančních prostředků.

Keywords

Tau agregáty, Alzheimerova choroba, sféroidy, tauopatie, tau seeding

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2023

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Viswanath Das, PhD.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Experimental Biology