Nové trendy v detekci apoptózy a autofágie u vybraných solidních nádorů

RNDr. Jan Balvan, Ph.D.

Doctoral thesis

New trends in detection of apoptosis and autophagy in selected solid tumors

Abstract:

Buněčná smrt hraje klíčovou roli nejen v mnoha fyziologických procesech, ale také téměř u všech lidských onemocnění. Její pochopení je podmíněno správnými metodickými přístupy v její analýze a hodnocení. V této práci byla sumarizována současná klasifikace jednotlivých typů buněčných smrtí a zhodnoceny metody jejich detekce. Na základě těchto poznatků je předložena nová metoda hodnocení buněčné viability spojená s detekcí morfologických procesů typických pro základní typy buněčné smrti (apoptóza a nekróza). Na buněčných liniích odvozených od solidních nádorů byla pomocí různých mikroskopických metod v průběhu času sledována buněčná morfologie. Klíčovou roli zde hrálo kvantitativní fázové zobrazování (QPI), které se zapojením moderních metod analýzy obrazu umožňuje citlivou kvantifikaci morfologických změn buňky. Tyto analýzy byly doplněny průtokovou cytometrií, konvenčními testy viability, sledováním hladin exprese na úrovni mRNA a proteinů. Na buněčných modelech solidních nádorů in vitro bylo prokázáno: 1) Pro správné hodnocení procesů buněčné smrti a rezistence je nezbytné zohlednit faktor času; 2) Distribuce buněčné hmoty v buňce se během procesů buněčné smrti silně mění, společným znakem je její závěrečný pokles pod určitou prahovou hodnotu; 3) Tvary křivek popisující jednotlivé morfologické parametry založené na sledování buněčné hmoty mají v případě apoptózy a nekrózy ty-pický tvar. Hodnocení buněčných procesů na základě analýzy dlouhých časosběrných záznamů bez použití jakýchkoli barviv inovativními kvantitativními přístupy může přinést cenné doplnění současných metod. Nové informace o vzájemném propojení a časové závislosti složitých procesů buněčné smrti a mechanizmů buněčné rezistence mohou sloužit k vývoji nových léčebných strategií v mnoha oblastech moderní medicíny.

Abstract:

Cell death plays a crucial role not only in physiological processes but also in almost all human diseases. Proper understanding is conditioned by appropriate methodical approaches in cell death analysis and assessment. This work summarizes recent classification of individual type of cell death modalities and provides the summary of methodological approaches for their detec-tion. On the basis of these findings, a new method for cell viability assessment is presented, enabling distinction of typical morphological parameters of apoptosis and necrosis. Experiments were performed in vitro on cell lines. MTT test and the analysis of cancer cell growth in the real-time were used to analyze the cytotoxic effect of antineoplastic drug. Gene and protein expression was analyzed by real-time PCR and by immunoassays. Morpho-logical parameters of cells were obtained using various microscopic techniques and flow-cytometry. QPI played the key role in these analyses. With the help of modern image analysis methods, QPI allows a sensitive quantification of cell morphological changes. We found that: (1) For proper cell death detection and resistance analysis, it is necessary to take the time factor into account; (2) Distribution of cell mass during the processes of cell death is significantly changing in time with a common steep decrease of the cell mass value dur-ing the rupture of the plasma membrane; (3) The shape curves describing individual morpholog-ical parameters of the cells during monitoring have a typical shape in the case of apoptosis and necrosis. Cell death assessment based on analysis of label-free long time-lapse records using innovative quantitative approaches can have a great value to supplement nowadays tech-niques. New information on the interconnection and time dependence of complex cell death processes and cell resistance mechanisms can serve to develop new therapeutic strategies in many areas of modern medicine.

Keywords

buněčná smrt, karcinom prostaty, apoptóza, autofagie, nekróza, kvantitativní fázové zobrazování, buněčná hmota, entóza, rezistence, buněčná linie cell death, prostate cancer, apoptosis, autophagy, necrosis, quantitative phase imaging, cell mass, entosis, resistance, cell lines

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 10. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 9. 11. 2017
• Supervisor: RNDr. Michal Masařík, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Physiology and Pathological Physiology (4-years) / Physiology and Pathological Physiology