Transformace Arabidopsis thaliana genem pro cytokinindehydrogenasu pod kořenově specifickým promotorem

Denisa Paulů

Bachelor's thesis

Transgenic Arabidopsis thaliana expressing cytokinin dehydrogenase gene under root specific promoter

Abstract:

Bakalářská práce se zabývá transformací rostlin Arabidopsis thaliana pomocí bakterie Agrobacterium tumefaciens, následnou selekcí a testováním těchto rostlin po-mocí metody PCR. První část teoretické části pojednává o rostlinných hormonech cytokininech, které mají důležitou roli v rostlinném vývoji a růstu, a cytokinindehydrogenase, což je enzym kataly-zující nevratnou deaktivaci cytokininů. S tímto tématem úzce souvisí kapitola transgenní rostliny se změněným obsahem cytokininů. Dalším zpracovaným tématem teoretické části je přímá a nepřímá transformace. Na závěr je vytvořen přehled vývoje transformace rostlin Arabidopsis thaliana pomocí bakterie Agrobacterium tumefaciens. V praktické části je popsána transformace rostlin Arabidopsis thaliana pomocí bakterie Agrobacterium tumefaciens, kmen GV 3101, nesoucí plazmid pBract 303 s genem pro kukuřičnou cytokinindehydrogenasu 1 (ZmCKX1) pod kontrolou kořenově specifického promotoru z ječmene (HvPHT 1-1). Dále je popsáno stanovení vhodné koncentrace fosfinotricinu pro selekci transformantů (5,5 mg/l) a testování vyselektovaných rostlin pomocí metody PCR. Bylo vyselektováno padesát čtyři rostlin z devíti set semen. Celkem bylo použito při PCR reakci šest dvojic primerů. U dvou dvojic primerů se vyskytly kontaminace v negativní kontrole nebo ve wild-type rostlině. Pouze u tří rostlin došlo pomocí jedné dvojice primerů k velice slabé amplifikaci části genu ZmCKX1. S použitím ostatních primerů k amplifikaci nedošlo. Jen dva ze tří endogenních genů byly amplifikovány z genomové DNA rostlin. Integrace transgenů nebyla tedy potvrzena v jedenapadesáti vyselektovaných rostlinách. Výsledky ani jednoznačně nepotvrzují inzerci transgenu ve třech rostlinách, z jejichž DNA byla získána slabá amplifikace genu ZmCKX1. V rámci bakalářské práce se nestihly provést další PCR amplifikace či jiné metody potvrzující transformaci, proto práce bude pokračovat během navazujícího studia

Abstract:

This bachelor?s thesis is focused on transformation of Arabidopsis thaliana media-ted by bacterium Agrobacterium tumefaciens, selection and verifying plants by PCR method. Theoretical part deals with plant hormones cytokinins and cytokinin dehydrogena-se. Cytokinins play a crucial role in plant growth and development and their degra-dation is mediated by enzyme cytokinin dehydrogenase (CKX). Transgenic plants with altered cytokinin content and methods of direct and indirect transformation including the development of Arabidopsis thaliana transformation are discussed. In the practical part, the transformation of Arabidopsis thaliana mediated by Agro-bacterium tumefaciens is described. Agrobacterium cells contained plasmid with the gene for maize cytokinin dehydrogenase 1 under the control of barley root-specific promoter (HvPHT 1-1). Further, suitable concentration of phosphinotricin for selection of transformants was determined (5.5 mg/l). Nine hundred seeds were put on selecti-on medium and fifty-four plants were obtained. PCR method was used for testing plants after transformation. PCR reactions with six different primer pairs were set up. Contamination in negative controls or in wild-type plants was observed in PCR reacti-ons performed with two different primer pairs. Very weak amplification of partial sequence of ZmCKX1 gene was obtained for three plants. Amplification with the other primers did not occur. These results did not clearly confirm the integration of transge-ne. Therefore, the study will continue during the master study programme

Keywords

Arabidopsis thaliana, cytokinindehydrogenasa, transformace, Agrobacterium tumefaciens, ?floral-dip?

Keywords

Arabidopsis thaliana, cytokinin dehydrogenase, trans-formation, Agrobacterium tumefaciens, ?floral-dip?

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 7. 6. 2010
• Supervisor: Šárka Vyroubalová
• Reader: Mária Šmehilová

Univerzita Palackého

Přírodovědecká fakulta

Bachelor programme / field:
Biochemie / Biochemie