Molekulární charakterizace vybraných kmenů améb rodu Naegleria, potenciálních lidských patogenů.

Klára ZÍTKOVÁ

Bachelor's thesis

Molecular characterization of selected strains of amoebae of the genus Naegleria, the potential human parasites.

Abstract:

Rod Naegleria patří mezi eukaryotické organizmy, které obecně označujeme jako améby (měňavky). Pojmenování je odvozené od způsobu jejich pohybu, při kterém mění svůj tvar. Améby neboli měňavky, zahrnují velké množství rozdílných a rozmanitých rodů se zástupci, kteří mohou být pro člověka patogenní stejně jako druh Naegleria fowleri. Např. rod Acanthamoeba a Entamoeba, původci akantamébové keratitidy resp. měňavkové úplavice a dalších závažných potíží. Přes povrchní podobnost nejsou negleriím příbuzné: patří mezi Amoebozoa, Naegleria mezi Heterolobosea. Nejvýznamnějším druhem tohoto početného rodu je améba Naegleria fowleri. Jako jediná je patogenní pro člověka a po nakažení způsobuje onemocnění, které se nazývá primární amébová meningoencefalitida. Invazivním stádiem je v případě neglérie měňavkový trofozoit. Přechodnou formou jejího životního cyklu je flagelát, nebo také bičíkovec; jejich charakteristickým znakem je přítomnost bičíků. Za nepříznivých podmínek se mění v rámci svého životního cyklu do stádia cysty. Velkou část práce zahrnují informace o druhu Naegleria fowleri a primární amébové meningoencefalitidě, kterou u člověka způsobuje (PAM). Objasňují se zde zdroje infekce a rizikové faktory napadení. Délka inkubační doby a objevení se prvních příznaků. Další kapitola se týká mechanismu vniknutí do organizmu, jak lze tuto infekci správně diagnostikovat a detekovat a také možnost léčby, při včasném rozpoznání vzniklých příznaků. Možnosti případné prevence a epidemiologie, zahrnující zmínku o největší epidemii, která proběhla v rámci České Republiky. V praktické části této práce je popsána vlastní studie s metodickým postupem, výsledky a vyhodnocením stanovených hypotéz. Cílem experimentální části byla analýza poskytnuté DNA neglerií. Na základě stanovených cílů a hypotéz jsem zjišťovala, o jaké druhy neglerií se konkrétně jedná. Výsledná fylogenetická analýza byla obohacena o vzorky, které již byly dříve sekvenované, ale nebyly dosud zahrnuty do žádné z analýz. První fáze studie zahrnovala izolaci DNA. Následujícím krokem bylo za pomoci PCR amplifikace a sekvenace ITS zjistit, zdali se opravdu jedná o améby rodu Naegleria, a poté zařazením do fylogenetické analýzy určit druhy tohoto rodu. Ke zpracování výsledných sekvencí jsem využila programu BioEdit a program ClustalX jsem použila pro alignování. Výsledné fylogenetické stromy byly vytvořeny za pomocí programu PAUP a jejich následná vizualizace proběhla díky programu TreeView. K samotnému sekvenování bylo využito služeb firmy Seqme.Za pomoci fylogenetických stromů se mi podařilo zjistit, kterým druhům zkoumané vzorky odpovídají a tím částečně potvrdit první z hypotéz, že bude možné zkoumané sekvence přiřadit k identickým druhům. Mezi výsledné druhy patří: N. americana zahrnující dva zástupce, s N. canariensis je celkem identických dvanáct vzorků, N. dobsoni dle fylogenetické analýzy odpovídají tři sekvence ITS a s N. pagei a N. tihangensis je shodný vždy jeden zástupce. Několik vzorků (GERK, MSED4, ALM1A, 62K4 a GG1BV) nebylo možné pomocí molekulárních metod identifikovat s žádným popsaným druhem a lze je považovat za druhy nové. Na základě tohoto zjištění bylo možné potvrdit druhou hypotézu, týkající se nedostatečného prozkoumání nových druhů a tedy potvrdit následné objevení pravděpodobně druhů nových. Data spíše potvrzují hypotézu č. 3 říkající, že na jedné lokalitě převládne vždy jeden (dominantní) druh rodu. A na základě tohoto částečně potvrdit hypotézu č. 4, která oponuje hypotéze č. 3.

Abstract:

The genus Naegleria is a eukaryotic organism, one of those we can call "amoeba" a general name of creatures changing their shape during their locomotion. Amoebae comprise a huge number of various different genera some of which contain species able to infect humans similar to Naegleria fowleri. Two important exaples are the genera Acanthamoeba and Entamoeba, causative agents of acanthamoeba keratitis or diarrhoea, respectively, and other serious symptoms. Although superficially similar, they are not close relatives of Naegleria: they belong to Amoebozoa, whereas Naegleria is a Heterolobosea. The most important species of this speciose genus is the amoeba Naegleria fowleri. Is is the only Naegleria which is a human pathogen. After infection, it causes primary amoebic meningoecephalitis. The invasive stage of Naegleria is an amoebic trophozoite. Under certain circumstances, it can transform in another form, the flagellate bearing undullipodia. When the conditions worsen, it changes in the resistant cyst stage. Major part of my work is related to Naegleria fowleri and primary amebic meningoencephalitis, which causes human (PAM). They clarify here the source of infection and risk factors for assault. The length of incubation period and the first appearance of symptoms. The next chapter concerns the mechanism of intrusion into the body, how can this infection properly diagnose and detect and also a treatment option, resulting in early detection of symptoms. Possibilities prevention and epidemiology, including presentation of biggest epidemic, that happened in the Czech Republic. In the practical part of this thesis summarize my own study and methods used, as well as the results and their interpretation. The aim of the experimental part was the analysis of Naegleria DNA maintained in the collection of the laboratory of fish pathogens. To reach my goal and test the hypotheses of this thesis, I identified the Naegleria isolates. The final phylogenetic analysis was enriched with samples sequenced earlier, but so far not analyzed in any previous work. The first step in the workflow was the DNA isolation. The next one was to PCR amplify and sequence the ITS sequences to confirm they belong to Naegeria species, and to analyze the sequences phylogeneticaly and identify the species. The obtained sequences were edited in BioEdit software, program ClustalX was used to align them. The phylogenetic trees were computed in PAUP. Sequencing was provided by Seqme company. During the interpretation of the phylogenetic trees, I found which species were present in studied samples. They were as follows: two samples were N. americana, twelve others N. canariensis, three were N. dobsoni and there were also N. pagei and N. tihangensis one sample each. Several samples (GERK, MSED4, ALM1A, 62K4 and GG1BV) were different from any known species and it is therefore possible to consider them new, undescribed species. On the basis of this fact we can confirm the hypothesis nr. two: the species diversity is understudied and the recognition of new species probable. The data seem to support hypothesis 3: in a given locality, a single dominant species becomes dominant. In some localities, however, we could not fully exclude the opposing hypothesis 4.

Keywords

Naegleria fowleri, primární amébová meningoencefalitida, molekulární charakterizace, sekvence genu SSU rDNA, ITS sekvence, PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 8. 2014

Accessible from:: 11. 8. 2014

Thesis defence

• Supervisor: doc. RNDr. Oleg Ditrich, CSc.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Studies

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Health Technician