Studium účinku fyzikálních podmínek v hyperbarické komoře na buňky

Ing. Jiří DEJMEK

Disertační práce

Anotace:

Hyperbarická oxygenoterapie (HBO) je běžně používaná podpůrná a terapeutická léčebná metoda využívající zvýšenou koncentraci kyslíku. Přestože se jedná o běžně užívanou léčbu, v odborné literatuře není dostatek podkladů pro plné pochopení biologických dějů, které v buňkách při těchto odlišných fyzikálních podmínkách probíhají. Práce měla vytčené tři cíle. Prvním cílem bylo vhodně shrnout fyzikálně-chemické vlastnosti kyslíku, popsat fyziologický metabolismus kyslíku až na mitochondriální úroveň a shrnout jeho medicínské využití a rizika. Druhým je vývoj nové a unikátní technologie malé hyperbarické komůrky uHBK, díky které by bylo možné studium vlivu podmínek HBO na buněčný metabolismus provést. Výstupem jsou dva typu komůrek uHBK 1 a 2. V práci je popsán jejich návrh doprovázený strojními výpočty, simulacemi a informacemi o vlastnostech a postupu vývoje. Technologie byla úspěšně patentována národním CZ patentem č. 28967. Třetím cílem práce je hodnocení účinku opakované expozice HBO na buněčnou linii lidských fetálních plicních fibroblastů (HFL1). Mitochondriální spotřeba kyslíku byla hodnocena metodou high-resolution respirometry (HRR), životaschopnost buněk hodnocena PrestoBlue?, morfologie analyzovaná rutinní fluorescenční mikroskopií a fázovým kontrastem a byla zhodnocena aktivita superoxiddismutázy (SOD) a citrátsyntázy (CS). Buňky byly vystaveny HBO (3 ATA) 2 hodiny denně po dobu 5 po sobě jdoucích dní. Den po poslední HBO expozici vykazovaly buňky podstatně menší plochu a obvod, sníženou životaschopnost a zvýšenou aktivitu SOD. Nebyly zjištěny žádné změny v aktivitě CS ani v kvalitě mitochondriální sítě. Respirometrie HRR odhalila sníženou mitochondriální spotřebu kyslíku, která se projevila snížením aktivity komplexu II a sníženou spotřebou kyslíku při oxidací mastných kyselin. Popsané výsledky dokládají, že v podmínkách napodobujících intermitentní expozici HBO trpí plicní fibroblasty zhoršenou mitochondriální respirací spojenou s komplexem II a poruchou buněčného růstu i při zvýšené antioxidační obraně. Mechanismus této HBO-indukované mitochondriální dysfunkce je nutné hlouběji prozkoumat. Nová technologie přípravy buněčných linií ovlivňovaných různými odlišnými fyzikálními podmínkami ve spolupráci s hodnocením mitochondriální respirometrie se jeví jako vhodná kombinace pro základní výzkum zaměřený na studium účinků HBO.

Abstract:

Hyperbaric oxygen therapy (HBO) is a commonly used supportive and therapeutic treatment method using increased oxygen concentration. Although it is a commonly used treatment, in the literature, there is an insufficient evidence to fully understand the biological processes that take place in the cells under these different physical conditions. The work is divided into three parts. The first part aims on summarizing the physico-chemical properties of oxygen, describe the physiological metabolism pathways of oxygen up to the mitochondrial level and to summarize its medical uses and risks. The second goal is the development of a new and unique technology of a small hyperbaric chamber uHBK, which would make it possible to study the effect of HBO conditions on cellular metabolism. The result is two types of Microhypebaric chambers uHBK 1 and 2. The thesis describes their design accompanied by mechanical and structural calculations, simulations and information about their properties and the development process. The technology was successfully patented by national CZ patent no. 28967. The third aim of the thesis is to study the effect of repeated HBO exposure on the human fetal lung fibroblasts (HFL1). Mitochondrial respiration was assessed by the high-resolution respirometry (HRR), cell viability estimated by PrestoBlue? reaction, morphology analyzed by routine phase contrast and fluorescent microscopy, and superoxide dismutase (SOD) and citrate synthase (CS) activities using human lung fibroblasts. The cells were exposed to HBO (3 ATA) for 2 hours per day for 5 consecutive days. One day after the last exposure, HBO cells displayed significantly smaller area and perimeter, compromised viability and elevated SOD activity. No changes were detected in CS activity or quality of mitochondrial network. HRR revealed impaired mitochondrial oxygen consumption manifested by increased leak respiration, decreased activity of complex II and compromised ATP-related oxygen consumption. Our findings document that in conditions mimicking chronic intermittent exposure to HBO, lung fibroblasts suffer from compromised mitochondrial respiration linked to complex II and impaired cellular growth in spite of increased antioxidant defense. Underlying mechanism of this HBO-induced mitochondrial dysfunction should be further explored. The new technology for the preparation of cell lines influenced by different physical conditions in conjunction with the evaluation of mitochondrial respirometry appears to be a suitable combination for basic research to study the effects of HBO.

Klíčová slova

HBO, hyperbarický, kyslík, biofyzika, komůrka, buňka, morfologie, viabilita, respirace, oxygrafie, mitochondrie

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 12. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 20. 2. 2019
• Vedoucí: MUDr. Lukáš Bolek, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Lékařská biofyzika / Lékařská biofyzika