Laboratorní diagnostika mykobakterií se zaměřením na bakteriologický průkaz

Martina VELKOVÁ

Bachelor's thesis

Laboratory diagnosis of mycobacteria, with a focus on the bacteriological proof

Abstract:

Laboratorní metody hrají důležitou roli v diagnostice onemocnění. I když jsou v současné době k dispozici rychlé molekulárně - genetické metody a metody založené na imunitní odpovědi organismu, základní vyšetřovací metodou přímého průkazu stále zůstává mikroskopický a kultivační průkaz. Mikroskopie je základní metodou pro většinu patologických vzorků, především pro sputum. Citlivost této metody není vysoká, přesto je důležitá. Umožňuje rychle odhalit rozsáhlá klinicky i epidemiologicky závažná onemocnění. U kultivačního průkazu se za ?zlatý standard? považuje kultivace na pevných vaječných půdách. V současné době bývá doplňována kultivací v automatickém detekčním systému, který urychluje dobu detekce. Tato práce byla prováděna v období 1.1. - 6.6. 2013 v Nemocnici Č. Budějovice a.s. v Laboratoři lékařské mikrobiologie, Pracoviště bakteriologie. Do studie bylo celkem zahrnuto 400 sput, které byly zpracovány a vyšetřovány. Cílem bylo ověřit a porovnat účinnost dekontaminačních metod za použití HCl a NALC. Zároveň byla sledována výtěžnost a doba detekce v klasické kultivaci a v automatickém detekčním systému BACTECTM MGITTM 960. Automatický systém využívá neradiometrickou fluorescenční technologii. Kultivace probíhá v tekutém Middlebrook 7H9 médiu s přídavkem antimikrobiálních látek (polymyxin B, amfotericin B, kyselina nalidixová, trimetoprim, azlocilin). U klasické kultivace byly použity pevné vaječné půdy: Löwenstein-Jensenova a půda podle Ogawy. Jednotlivé výsledky pak ukazují, že u metody s HCl byla kontaminace celkem u 1 % vzorků. Pro jednotlivé metody pak v 5 % v BACTECTM MGITTM 960 a 4 % v klasické kultivaci. Ve srovnání u metody s NALC byla kontaminace celkem u 21 % vzorků a z toho pro jednotlivé metody 26 % v BACTECTM MGITTM 960 a 50 % v klasické kultivaci. Z těchto výsledků je tedy patrné, že metoda s NALC má nižší účinnost, podíl kontaminace oproti metodě s HCL se zvýšil o 20 %. Dekontaminační metoda s NALC je doporučena výrobcem pro BACTECTM MGITTM 960. Byla ale shledána nevyhovující a nebylo v ní možné nadále pokračovat. Porovnáním výtěžnosti a doby detekce izolovaných kmenů u jednotlivých metod bylo prokázáno, že BACTECTM MGITTM 960 vykazuje větší citlivost než klasická kultivace, neboť ze 17 celkem izolovaných kmenů BACTECTM MGITTM 960 zachytil 15 oproti 10 izolovaným kmenům v klasické kultivaci. Patrný je i výrazně kratší čas detekce pozitivních vzorků. Průměrný čas detekce u BACTECTM MGITTM 960 byl 16,2 dní, zatímco u klasické kultivace 31 dní. Potvrdilo se, že systém BACTECTM MGITTM 960 dosahuje lepších výsledků, ale optimalizace je dosaženo kombinováním obou používaných metod. Ze zpracovaných statistických údajů za období 2010 - 2012 je patrný pokles, ale k výraznému snížení nedochází. Znatelný je pouze pokles Mycobacterium bovis BCG, což se dá vysvětlit tím, že očkování proti tuberkulóze není již od roku 2011 prováděno plošně, ale podle nové platné legislativy pouze u rizikových skupin. Zajímavou skutečností je i to, že každoročně je v laboratoři nejvyšší záchyt ve věkové skupině nad 60 let.

Abstract:

Laboratory methods play an important role in disease diagnostic. Although there are currently available fast molecular genetic methods and methods based on cell response, basic diagnostic method of direct evidence is still microscopy and cultivation. Microscopy (staining by Ziehl-Neelsen and fluorescence microscopy) is the primary method for most of the specimens, especially for sputum. The sensitivity of this method is not very high because for the detection of a positive finding in 1 mm3 is needed at least 105 microbes. However, the method is important because it can fastly proof extensive clinical and epidemiological serious diseases. The ?Golden standard? is today the cultivation on solid egg media. Nowadays it is filled in automatic detection system, which accelerates the time of detection. The thesis was carried out in the Laboratory of Medical Microbiology, Bacteriology department, Hospital Ceske Budejovice in the period from 1.1.2013 till 6.6.2013, and included 400 sputa, which were processed and examined. The purpose was to compare the effectiveness of decontamination methods with HCl and with NALC, and to monitor the recovery and detection for the automatic detection system and conventional cultivation. In the automatic system using the BACTECTM MGITTM 960 Non-Radiometric fluorescent technology is cultivation in liquid Middlebrook 7H9 medium supplemented with antimicrobials (polymyxin B, amphotericin B, nalidixic acid, trimethoprim, azlocilin). The classical culture used solid egg culture medium: Lowenstein-Jensen and culture medium by Ogawa. The individual results then show that the method of HCl had the overall contamination of 1 % of the samples. For each methods in 5 % BACTECTM MGITTM 960 and 4 % in the conventional cultivation. In comparison the method NALC, had the overall contamination of 21 % of the samples. For the individual methods in 26 % of BACTECTM MGITTM 960 and 50 % in the conventional cultivation. From these results it is obvious that the method with the NALC has lower efficiency, the proportion of contamination compared to the method with HCL increased by 20 %. Decontamination with the NALC method recommended by the manufacturer for BACTECTM MGITTM 960 was found to be unsatisfactory and was canceled. Comparing the recovery and the detection of the strains isolated in individual methods showed that the BACTECTM MGITTM 960 exhibits greater sensitivity than conventional cultivation, since the total of 17 strains isolated BACTECTM MGITTM 960 captured 15 against 10 strains isolated in conventional cultivation. There is also a significantly shorter time to detect positive samples. The average detection time for BACTECTM MGITTM 960 was 16.2 days, while a conventional culturing was 31 days. It was confirmed that the BACTECTM MGITTM 960 system achieves better results, but optimization is achieved by combining the two methods used. There is an apparent decrease in detection of mycobacteria from the processed statistical data of the strains isolated during the period 2010 - 2012, but a substantial reduction does not occur. Noticeable is only the decline of the isolated stains of Mycobacterium bovis BCG, which can be explained by the fact that the vaccination against tuberculosis is since 2011 no longer carried out across the board, but according to the new legislation in force only in high-risk groups. An interesting fact is that every year the highest laboratory detection is found in the age group of over 60 years.

Keywords

BACTECTM MGITTM 960, dekontaminační metoda, HCl, klasická kultivace, mykobakterium, NALC, NTM

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 8. 2013

Accessible from:: 14. 8. 2013

Thesis defence

• Supervisor: MUDr. Petra Dovinová

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Studies

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Zdravotní laborant