Mutační analýza obalového proteinu X viru bramboru (PVX)

Markéta Werschallová

Master's thesis

Mutational analysis of Potato virus X (PVX) coat protein

Abstract:

Předkládaná diplomová práce se zabývá mutační analýzou konzervovaných aminokyselin obalového proteinu (CP, coat protein) X viru bramboru (PVX, Potato virus X), kterou má být zjištěna důležitost vybraných aminokyselin pro šíření viru v rostlině. Jako pokusné rostliny byly vybrány tabáky Nicotiana benthamiana. Modifikace v obalovém proteinu byly provedeny na základě porovnání aminokyselinové sekvence obalového proteinu PVX s CP viru mozaiky papáji (PapMV CP, Papaya mosaic virus coat protein), zatím jediného zástupce potexvirů, kam patří i PVX, s popsanou krystalovou strukturou obalového proteinu, u kterého byla experimentálně potvrzena důležitost určitých aminokyselin pro interakci podjednotek obalového proteinu CP,CP PapMV a CP,RNA a tím i pro tvorbu virových částic. Z databáze National Center for Biotechnology Information (NCBI) byly získány dostupné aminokyselinové sekvence izolátů a kmenů PVX CP, které byly porovnány mezi sebou, ale i se sekvencí PVX využívanou v Laboratoři virologie ÚEB, AV ČR v. v. i. Jako konzervované pozice byly určeny kodóny kódující fenylalanin a lysin v pozici 33 a 118 obalového proteinu, které byly mutovány pomocí metod molekulární biologie. Celkem bylo vytvořeno 5 konstruktů mutantů obalového proteinu, 2 deleční mutanti N- konce PVX CP, kteří byli vytvořeni ve vektoru odvozeném od PVX (pGR106), ve kterém je integrována cDNA sekvence PVX, zbylí 3 bodoví mutanti byli vytvořeni pouze jako produkt SOE PCR. Do delečních mutantů, u nichž byla odstraněna větší část N- koncové sekvence CP, přesněji sekvence mezi 2.,32. a 2.,33. kodónem, byl zaklonován vytvořený reportérový gen GFP pro sledování nástupu signálu infekce a šíření mutantů v rostlinných pletivech. Ve výsledku se oba mutanti šířili pouze z místa agroinfiltrace do okolních buněk inokulovaného listu. Rozdíl byl zaznamenán jak v rychlosti nástupu signálu GFP, tak i v míře rozšíření mutantů do okolních buněk. Deleční mutant s ponechaným kodónem pro F33 vykazoval jednak rychlejší nástup signálu, ale byl schopen se šířit mnohem rychleji a výrazněji do okolních buněk, ale pouze v rámci inokulovaného listu, zatímco u delečního mutanta s odstraněným kodónem pro F33 byl zaznamenán pomalejší nástup signálu a menší schopnost infikovat okolní buňky. Dále byli vytvořeni bodoví mutanti, deleční a substituční, konkrétně deleční mutant kodónu F33 (delece F33), substituční mutant, u kterého byl kodón fenylalaninu v pozici 33 nahrazen kodónem alaninu (F33A) a substituční mutant, u kterého byl kodón lysinu v pozici 118 nahrazen kodónem alaninu (K118A). Bohužel se nepodařilo bodové mutanty úspěšně vložit do vektoru pGR106, tudíž nebylo možné je zhodnotit v rostlinách N. benthamiana. Z uvedených výsledků lze usuzovat na důležitost aminokyseliny F33 při mezibuněčném pohybu v rámci sousedních buněk. Pro posouzení důležitosti F33 a K118 v systémové infekci by bylo nutné zhodnotit i bodové mutanty delece F33, F33A a K118A.

Abstract:

The thesis deals with the mutational analysis of conserved amino acids of Potato virus X coat protein (PVX CP). The importance of selected amino acids for the spread of the virus in the plant should be determined. Nicotiana benthamiana was selected as an experimental plant. Mutations of the PVX CP were based on the comparison of PVX CP amino acid sequence with the sequence of Papaya mosaic virus coat protein (PapMV CP), the only representative of potexvirus, which includes PVX, with the described crystal structure of the CP. The importance of certain amino acids for interaction of coat protein subunits PapMV CP,CP and PapMV CP,RNA and thus for virus particles formation was experimentally determined. The available amino acid sequences of isolates and strains of PVX CP were obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database, compared with each other and alsowith the sequence of PVX CP used in the Laboratory of Virology, Institute of Experimental Botany of the CAS. Codons encoding conserved phenylalanine and lysine at positions 33 and 118 in the PVX CP amino acid sequence were mutated using methods of molecular biology. Five constructs of PVX CP mutants were prepared, Two deletion mutants of the PVX CP N-terminus which were created in the vector derived from PVX (pGR106) in which the cDNA sequence of PVX is integrated, the remaining 3 point mutants were prepared only as a product of SOE PCR. The reporter gene GFP for monitoring of infection and spread of mutants in plant tissue was cloned into pGR106 carrying the deletion mutants of the N-terminus of PVX CP (deletion of 2.-32. or 2.-33. amino acid). Both mutants are able to move only in a short distance from infected cells to adjacent cells within the inoculated N. benthamiana leaf. These two deletion mutants showed difference in the speed and in the extent of the GFP signal spread. Deletion mutant still possessing the codon for F33 showed faster onset of the GFP signal and was able to spread more rapidly to surrounding cells in comparison with deletion mutant, where the codon for F33 was removed. Other mutants carrying the point mutations were also prepared: the deletion mutant of the codon for F33 (deletion F33), the substitution mutant, in which the codon for phenylalanine at position 33 was replaced by the codon for alanine (F33A) and substitution mutant, where the codon for lysine at position 118 was replaced by the codon for alanine (K118A). Unfortunately, all three point mutants could not be cloned into the vector pGR106, therefore, the evaluation of their spread in N. benthamiana plants was not possible. Based on obtained results it is possible to conclude that the amino acid F33 is important for the intercellular movement within the neighboring cells. To assess the importance of the amino acids F33 and K118 in the systemic infection, it would be necessary to evaluate also the point mutants deletion F33, F33A, and K118.

Keywords

X virus bramboru, obalový protein, interakce CP, mutanti

Keywords

interaction of CP, Potato virus X, coat protein, mutants

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Pavel Ryšánek, CSc.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Plant Protection / Plant Protection