Sledovanie počtu kópií génov hrpM a talB izolátov baktérie Xanthomonas campestris pv. campestris pomocou Real-time PCR

Bc. Alena Výbošťoková

Master's thesis

Sledování počtu kopií genu hrpM a talB izolátů bakterie Xanthomonas campestris pv. campestris pomocí Real-time PCR

Abstract:

Hlavním tématem této práce je bližší specifikace Xathomonas campestris pv. campestris, patogenu, který nejvíce postihuje rostliny z čeledi Brassicaceae, kde způsobuje osivem přenosnou černou bakteriální žilkovitost. Při posunu patogena cévním systémem, dochází k tvorbě extracelulárního polysacharidu, xantánu, který ucpává cévní svazky, čímž způsobuje černání listů a postupné odumírání celé rostliny. Obrovská hrozba patogenu spočívá nejen v tom, že bakterie je schopna přežít v půdě, bez přítomnosti hostitele 40 dní, ale hlavně skutečnost, že ani v dnešní pokrokové době neevidujeme vhodná antibiotika na její eliminaci. Z tohoto vyplývá obrovská potřeba preventivních opatření. Je nezbytné aby byl patogen včas detekován a tím se zastavilo jeho šíření.V současnosti existuje značné množství detekčních metod s různým stupněm přesnosti. V této práci byly otestovány dva detekční systémy. Pro potvrzení přítomnosti Xcc byly navrženy dvojice primerů cieliacich oblasti genů hrpM a talB. Ověření citlivosti, specifity a účinnosti detekce proběhlo prostřednictvím standardní PCR a Real-time PCR. Specifita standardní PCR nebyla dostatečná v případě obou genů, protože kromě cílového produktu Xcc došlo k amplifikaci i necílových produktů. Ani přístup Real-time s využitím SYBR Green neprokázal vhodnost použití pro detekci Xcc. Výsledky práce nepotvrdily dostatečnou specifitu nově navržených detekčních systémů.

Abstract:

The main topic of the diploma thesis is closer characteristic of Xathomonas campestris pv. campestris, the pathogen that seriously affects Brassica family, causing seed-borne disease – Black rot of Brassica. As the pathogen moves down the vascular system, the extracellular polysaccharide, xanthan, is created, blocking the vessels and causing blackening of leaves, which slowly result in the death of the whole plant. The major threat that Xcc represents is not only the ability to survive in the soil without any host organism for 40 days, but mainly it is the fact that, despite the modern age, we still do not have proper antibiotics that could possibly eliminate the pathogen. This lead to the conclusion, that the prevention is extremely necessary, in order to detect the pathogen and thus eliminate its spread.Nowadays, there exist quite a large amount of methods that deals with detection of bacteria. In this diploma thesis, two systems were tested. In order to confirm the presence of Xcc, two pairs of primers were designed, targeting hrpM and talB genes. The sensitivity, specificity and efficiency were tested using PCR and Real-time PCR. Specificity of standard PCR was not sufficient in case of hrpM gene as well as talB gene, because apart from Xcc, other, non-targeting products were amplified. The use of the Real-time method with SYBR Green showed us that primers are inappropriate for detection of Xcc.

Abstract:

Hlavnou témou tejto diplomovej práce je bližšia špecifikácia baktérie Xathomonas campestris pv. campestris, patogéna, ktorý je pôvodcom čiernej bakteriálnej škvrnitosti. Pri posune patogéna cievnym systémom, dochádza k tvorbe extracelulárneho polysacharidu, xantánu, ktorý upcháva cievne zväzky, čím spôsobuje černanie listov a postupné odumieranie celej rastliny. Obrovská hrozba patogéna spočíva nie len v tom, že baktéria je schopná prežiť v pôde bez prítomnosti hostiteľa 40 dní, ale hlavne skutočnosť, že ani napriek dnešnej pokrokovej dobe neevidujeme účinné prostriedky na jej elimináciu. Z tohto vyplýva obrovská potreba preventívnych opatrení. Je nevyhnutné aby bol patogén včas detekovaný a tým sa zastavilo jeho šírenie. V súčasnosti existuje značné množstvo detekčných metód s rôznym stupňom presnosti. V tejto práci boli otestované dva detekčné systémy. Pre potvrdenie prítomnosti Xcc boli navrhnuté dvojice primerov cieliacich oblasti génov hrpM a talB. Overenie citlivosti, špecifity a účinnosti detekcie prebehlo prostredníctvom štandardnej PCR a Real-time PCR. Špecifita štandardnej PCR nebola dostatočná v prípade oboch génov, pretože okrem cieľového produktu Xcc došlo k amplifikácii aj necieľových produktov. Ani prístup Real-time s využitím SYBR Green nepreukázal vhodnosť použitia pre detekciu Xcc.

Keywords

Xathomonas campestris pv. campestris, patogen, Real-time PCR, gen hrpM, gen talB, černá bakteriální žilkovitost

Keywords

the Black rot, Real-time PCR, Xathomonas campestris pv. campestris, gene hrpM, gene talB, pathogen

Keywords

čierna bakteriálna škvrnitosť, Xathomonas campestris pv. campestris, patogén, Real-time PCR, gén hrpM, gén talB

Language used: Slovak

Date on which the thesis was submitted / produced: 22. 6. 2020

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Aleš Eichmeier, Ph.D.
• Reader: Tomáš Kiss, Ing.

Mendel University in Brno

Faculty of Horticulture

Master programme / field:
Horticultural Engineering / Horticulture