Are Tau fibrils induced by phosphorylation and the interaction with 14-3-3 proteins relevant for Alzheimer's disease?

Gytis Kučinskas, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Alzheimerova choroba (AD) zůstává jedním z hlavních celosvětových zdravotních problémů a stále postrádá skutečně účinnou, průlomovou terapii. Navzdory pokroku v pochopení patologie zůstávají tauopatie a molekulární mechanismus tvorby neurofibrilárních klubek (NFTs) nejasné. Testovali jsme dříve popsané podmínky se studií plné délky Tau proteinu in vitro s cílem identifikovat faktory klíčové pro fibrilizaci. Ačkoli se nám nepodařilo vytvořit párové helikální filamenty (PHF) ani přímé filamenty (SF) za in vitro podmínek, určili jsme faktory, jako je délka Tau proteinu, prostředí pufru, elektrostatické interakce, teplota, doba inkubace a mechanická agitace, které jsou zásadní pro tvorbu fibril Tau proteinu plné délky. Dále jsme testovali několik kináz jako kandidáty pro fosforylaci, abychom určili, jak fosforylace, převážně v oblasti C-konce, ovlivňuje afinitu vazby na mikrotubuly. Kináza GSK3β byla vybrána jako nejvhodnější kandidát pro měření pomocí NMR. Během [1H-15N] HSQC NMR titračního experimentu jsme prokázali, že samotná fosforylace pomocí GSK3β není schopna způsobit odpojení Tau od různých typů mikrotubulů. Tento poznatek, ve spojení s dříve publikovanými výsledky, naznačuje, že Tau musí být fosforylován i jinými kinázami, nebo že existuje kaskádový systém fosforylace ovlivňující afinitu Tau k mikrotubulům. Navíc jsme zkoumali, jak 14-3-3 psWTζ, protein hojně zastoupený v mozku a přítomný i v neurofibrilárních klubkách, ovlivňuje tvorbu fibril fosforylovaného Tau pomocí GSK3β. Zajímavé je, že za našich optimalizovaných podmínek 14-3-3ζ psWT významně inhibuje tvorbu fibril. Toto tvrzení bylo podloženo srovnáním kvantitativní metody ThT testu a vizualizačních metod NS-EM a AFM. Tato zjištění naznačují, že protein 14-3-3 může hrát ochrannou roli v průběhu AD; nicméně je zapotřebí další analýza.

Abstract:

Alzheimer’s Disease (AD) remains one of the major global health challenges, still lacking a truly effective, blockbuster therapy. Despite the progress in understanding the pathology, Tauopathies and the molecular mechanism of NFTs formation remain unclear. We tested previously reported conditions with full-length Tau protein studies in vitro to identify the factors that are crucial in fibrillisation. Despite we did not manage to generate pair helical filaments (PHF) and straight filaments (SF) fold in in vitro conditions, we determined factors such as length of the Tau protein, buffer environment, electrostatic interactions, temperature, time of incubation, and mechanical agitation, that are crucial for full-length Tau fibril formation. Moreover, we tested several kinases as phosphorylation candidates to determine how phosphorylation predominantly around the C terminus impacts the binding affinity to the microtubules. GSK3β kinase was selected as the most suitable candidate for NMR measurement. During the [1H-15N] HSQC NMR titration experiment, we demonstrated that phosphorylation by GSK3β alone cannot cause Tau’s detachment from different types of microtubules. This finding, combined with previously reported results, suggests that Tau has to be phosphorylated by other kinases, or there is a cascade system of phosphorylation in Tau’s affinity for binding to microtubules. Additionally, our research tested how 14-3-3 psWTζ, an abundant protein in the brain that is also present in neurofibrillary tangles (NFTs), impacts the formation of GSK3β-phosphorylated Tau fibrils. Interestingly, in our optimised conditions, 14-3-3ζ psWT significantly inhibits the formation of fibrils. Such a conclusion was made by comparing the quantitative method of ThT assay and the visualisation methods of NS-EM and AFM. These findings suggest that 14-3-3 protein can play a protective role in AD; however, further analysis is needed.

Keywords

Alzheimer's Disease, Tau, GSK3β, PKA, Fibrils, 14-3-3, NMR, Cryo-EM, AFM, ThT assay.

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 3. 7. 2025

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 29. 7. 2025
• Vedoucí: doc. RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.
• Oponent: izr. prof. dr. Miha Lukšič, doc. RNDr. Zuzana Gažová, DrSc, Univ.Prof. Dr. José Luis Toca-Herrera

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Vědy o živé přírodě / Vědy o živé přírodě