The role of Anterior gradient proteins in EMT

Mgr. Lucia Sommerová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Během progrese nádoru může, prostřednictvím procesu nazývaným epiteliálně-mezenchymální tranzice (EMT), docházet k přeprogramování epiteliálních nádorových buněk na buňky vykazující mezenchymální fenotyp a zvýšený migrační potenciál. Tento proces se významnou měrou podílí na progresi nádoru a vzniku metastáz. Význam proteinu anterior gradient 2 (AGR2) ve vývoji a progresi nádorového onemocněni je v současné době intenzivně studován. Bylo prokázáno, že AGR2 protein reguluje některé buněčné procesy, včetně buněčné proliferace, zvýšeného přežití nádorových buněk a rozvoje lékové rezistence. Nicméně, mechanismus působení, stejně jako další funkce proteinu AGR2 zůstávají v řadě aspektů nejasné. V rámci této práce, bylo zjištěno, že působení TGF-β vedlo k indukci EMT procesu za současného snížení hladiny AGR2. Inhibice AGR2 exprese byla doprovázena ztrátou epiteliálního E-kadherinu spolu s manifestací klasických znaků mezenchymálních buněk, jako je zvýšená exprese N-kadherinu a morfologické změny vyplývající z cytoskeletální reorganizace, které zahrnují difúzní cytoplazmatickou distribuci vimentinu, re-lokalizaci F-aktinu a tvorbu stresových vláken in vitro. Naopak, zvýšená exprese AGR2 způsobila potlačení mezenchymálních markerů a vedla k reverznímu navození epiteliálnímu fenotypu. Aktivace signálních kaskád Smad a ERK byla prokázána jako nezbytná pro potlačení AGR2 exprese po působení TGF-β. Dále jsme pozorovali, že zvýšení exprese dvou transkripčních faktorů spojených s EMT, ZEB1 a SNAI2, úzce koreluje se ztrátou AGR2. Bylo potvrzeno, že ZEB1 se přímo váže na promotor genu AGR2 a působí jako molekulární represor AGR2 transkripce. Důležitým zjištěním také bylo, že umlčení exprese AGR2 indukovalo hladinu ZEB1 i SNAI2, a navíc přispívalo k jejich akumulaci v jádře. Vliv AGR2 na expresi transkripčních faktorů spojených s EMT může sloužit jako vysvětlení mechanizmu, kterým se protein AGR2 podílí na přepínání mezi dvěma buněčnými fenotypy. Navíc, buňky s umlčenou expresí AGR2 mají narušené mezibuněčné interakce, sníženou schopnost adherovat, ale současně silnější schopnost invadovat. Mimo to, nádorové buňky se stabilním umlčením AGR2 exprese tvoří ve zvýšené míře metastázy do vzdálených tkání in vivo v porovnání s buňkami s endogenní expresí AGR2. Nicméně, ztráta AGR2 je spojena s pomalejším růstem primárních nádorů u myších xenograftů. Kromě objasnění regulace AGR2 během EMT procesu jsme také identifikovali nový molekulární mechanismus, zapojený do regulace exprese AGR2. Naše studie odhalila přímý dopad délky 3'-nepřekládané oblasti (3'UTR) mRNA kódující gen AGR2 na jeho expresi na úrovni proteinu. Zkrácení 3'UTR pak významně korelovalo nejen se zvýšenou hladinou proteinu AGR2 in vitro, ale i s expresí AGR2 v klinických vzorcích odebraných od pacientek s karcinomem prsu. Dále jsme zjistili, že zkrácení 3'UTR je regulováno aktivací signální kaskády mTOR. Tyto výsledky přispívají k vysvětlení komplexních mechanismů, které se podílejí na regulaci exprese AGR2 v nádorech, a nabízejí nový směr terapie u nádorových onemocnění se zvýšenou expresí AGR2, kde se v rámci kombinované terapie nabízí inhibovat signální dráhu řízenou mTOR. Navíc naše analýza prokázala, že exprese AGR2 pozitivně koreluje s expresí HER2 u nádorů prsu nezávisle na přítomnosti estrogenového receptoru a je spojena s horší prognózou. Naše výsledky přispěly k objasnění úlohy AGR2 při metastazování, kde tento protein pozitivně reguluje epiteliální fenotyp, přičemž zvýšená exprese AGR2 brání aktivaci procesu epiteliálně-mezenchymální tranzice. Zároveň jsme identifikovali mechanismus, který je zodpovědný za

Abstract:

zvýšení hladiny AGR2 během vývoje a progrese nádoru a posiluje význam AGR2 jako důležitého diagnostického a prognostického markeru u různých typů nádorových onemocnění.

Abstract:

During cancer progression, epithelial cancer cells can be reprogrammed into mesenchymal-like cells with an increased migratory potential through the process of the epithelial-mesenchymal transition (EMT) representing the essential step of tumor progression towards a metastatic state. The role of anterior gradient protein 2 (AGR2) in a tumor development and a progression has become intensively studied. AGR2 protein was shown to regulate several cancer-associated processes including cellular proliferation, survival and drug resistance. However, the mechanism of action, as well as the scope of AGR2 functions remains largely unclear. We found that EMT induced by TGF-β was associated with decreased AGR2 level. The reduction of AGR2 was concomitant with the classical features of mesenchymal cells such as loss of epithelial E-cadherin, induction of N-cadherin and morphological changes arising from cytoskeleton reorganization including diffuse cytoplasmic distribution of vimentin, re-localization of F-actin and formation of stress fibers in vitro. Conversely, an overexpression of AGR2 caused reversion of the mesenchymal phenotype back to the epithelial phenotype by suppression of mesenchymal markers. Activated Smad and ERK signaling cascades were identified as mutually complementary pathways responsible for TGF-β-mediated suppression of AGR2. Additionally, we observed that the upregulation of EMT-related transcription factors ZEB1 and SNAI2 correlates with downregulated AGR2 in response to TGF-β. We confirmed that direct binding of ZEB1 to AGR2 gene promoter repressed AGR2 expression. Importantly, the loss of AGR2 expression induced both ZEB1 and SNAI2 and facilitated their nuclear accumulation, thus explaining a potential mechanism how AGR2 may regulate the shift between cellular phenotypes. Moreover, cells without AGR2 expression have impaired cell-cell interaction and weaker adhesive abilities but an increased invasiveness. Consistently, tumor cells with stable AGR2 gene knockout show higher propensity to colonize distant tissues in vivo, which results in increased metastasis formation compared to cells with endogenous AGR2 expression. On the other hand, AGR2 knockout is associated with impaired growth of primary tumors in mouse xenografts. Apart from an elucidation of AGR2 regulation during EMT, we also identified the new molecular mechanism directly involved in the regulation of AGR2 expression. Our study, focused on AGR2 mRNA, revealed a direct impact of a length of its 3'-untranslated region (3'UTR)on AGR2 expression, since 3'UTR shortening significantly correlates with increased AGR2 protein levels in vitro as well as in the breast cancer patients' samples. Furthermore, we identified that AGR2 3'UTR shortening is regulated by activation of mTOR signaling cascade. These findings contribute to the explanation of the complex mechanisms involved in upregulation of AGR2 in tumors and offer a new direction to design the therapy of tumors overexpressing AGR2 in combination with the inhibition of mTOR signaling. In addition, our analysis of AGR2 expression in consecutive cohort of breast cancer biopsies revealed that AGR2 expression positively correlates with HER2 expression independently of estrogen receptor and is associated with worse prognosis. Taken together our results elucidated the pro-metastatic role of AGR2 as the “keeper” of epithelial phenotype by preventing the process of epithelial-mesenchymal transition. Moreover, we identified the mechanism that is responsible for the increased levels of AGR2 during tumor development and progression and strengthen the role of AGR2 as the important diagnostic and prognostic marker in various cancers.

Keywords

AGR2, metastasis, epithelial-mesenchymal transition, cancer progression, metastázováni, epiteliálně-mezenchymální tranzice, progrese nádorového onemocnění

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 9. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 15. 11. 2018
• Supervisor: doc. Mgr. Roman Hrstka, Ph.D.
• Reader: doc. Mgr. Václav Brázda, Ph.D., doc. RNDr. Vladimír Kryštof, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biochemistry