Molekulární typizace Staphylococcus aureus založená na detekci polymorfizmů profágů

Mgr. Dagmar Čížková, Ph.D.

Diplomová práce

Anotace:

Cílem této práce bylo hodnocení metody profágové typizace provedené pomocí selektivní hybridizace se směsí fágových sond, ve smyslu její použitelnosti k typizaci blízce příbuzných kmenů S. aureus a její srovnání se stávajícími typizačními metodami. Nejdříve byla připravena směs profágově specifických hybridizačních sond značených digoxigeninem. Za tímto účelem byla identifikována a naklonována sekvence specifická pro fágovou seroskupinu Fb (fágový druh 77) a dvě univerzální fágové sekvence. Kromě nich byly k přípravě molekulárních sond použity také dříve naklonované sekvence specifické pro ostatní fágové seroskupiny (A, B, Fa a L) respektive druhy (3A, 11, 77 a 187). Směs fágově specifických sond byla hybridizována s HindIII a ClaI restrikčními spektry 18 příbuzných epidemických meticilin resistentních nemocničních kmenů S. aureus z několika nemocnic v Praze a Brně. Po zhodnocení výsledných DNA fingerprintů byla zjištěna 100% typovatelnost pro obě hybridizace a srovnatelné, poměrně vysoké hodnoty rozlišovací síly (77 % respektive 75 %). Dalším krokem bylo provedení pulzní gelové elektroforézy. Výsledné SmaI makrorestrikční spektrum bylo nejprve podrobeno RFLP analýze a poté hybridizováno se směsí fágově specifických sond. Typovatelnost profágové typizace pomocí SmaI hybridizace byla opět 100 %, zatímco rozlišovací síla 69 % byla o něco nižší než u předchozích hybridizací. Typizace pomocí PFGE se ukázala být metodou s nejvyšší rozlišovací silou 81 %, což je však výsledek srovnatelný s typizací pomocí HindIII hybridizace se směsí fágově specifických sond. Výše uvedené hodnoty typovatelnosti a rozlišovací síly byly srovnány s výsledky sedmi dalších typizačních metod, provedených na stejném souboru kmenů (test citlivosti k antibiotikům, fagotypizace, profágová typizace prostřednictvím multiplex PCR, RAPD, ribotypizace, SCCmectypizace, restrikční analýza plazmidů). 100% typovatelnost vykazovaly kromě plazmidové typizace a fagotypizace také všechny ostatní metody. Ze srovnání všech typizačních metod vykázaly nejvyšší rozlišovací sílu metody provedené v této práci v pořadí: PFGE-typizace, HindIII profágová typizace, ClaI profágová typizace a SmaI profágová typizace. Na základě dosažených výsledků lze konstatovat, že metoda profágové typizace pomocí hybridizace se jeví jako vhodná typizační metoda k rozlišení blízce příbuzných kmenů S. aureus. Typovatelnost pomocí této metody je 100 % a její rozlišovací síla je srovnatelná s rozlišovací silou PFGE-typizace.

Abstract:

Molecular typing of Staphylococcus aureus based on the detection of polymorphisms in prophages. The aim of this work was to evaluate the potential of hybridization-based prophage typing as a method for typing of closely related strains of Staphylococcus aureus. The first part of the work included preparation of digoxigenin labeled, phage specific hybridization probes. For this purpose, serological group Fb (phage species 77) specific sequence and two universal phage sequences were identified and cloned. These were used for the preparation of molecular probes, together with the previously cloned phage sequences specific for other phage serological groups (A, B, Fa a L) and/or phage species (3A, 11, 77 and 187 respectively). The probes were mixed and hybridized with HindIII and ClaI restriction endonuclease patterns of 18 related epidemic methicillin-resistant hospital strains of S. aureus isolated in several hospitals in Brno and Praha. Resulting fingerprints were evaluated. Both hybridizations gave 100% typeability and their discriminatory powers were relatively high and similar to each other (77% and 75% respectively). Next, pulse field gel electrophoresis was performed. Resulting SmaI macrorestriction patterns were analysed and followed by selective hybridization with phage specific probes. Typeability of prophage typing by means of SmaI hybridization was 100% as for previous hybridizations, while discriminatory power was slightly lower, reaching 69 %. PFGE typing turned out to be a method with the highest discriminatory power, reaching up to 81 %, though this value is comparable to that of HindIII hybridization. The above listed values of typeability and discriminatory power were compared with results of seven other typing methods performed on the same set of strains peviously, incuding antibiotic susceptibility testing, phage typing, PCR-based prophage typing, RAPD, ribotyping, SCCmec-typing and restriction analysis of plasmids. All methods, apart from phage typing and plasmid typing, showed 100% typeability. When all discriminatory powers were compared, the methods performed in this work reached the highest values in the given order: PFGE-typing, HindIII prophage typing, ClaI prophage typing and SmaI prophage typing. The lowest discriminatory power was that of ribotyping. On the basis of achieved results, it is possible to make a conclusion, that the hybridization-based method of prophage typing seems to be a suitable method for distinguishing between closely related strains of S. aureus. Typeability of this method is 100 % and its discriminatory power is comparable to that of PFGE.

Klíčová slova

Staphylococcus aureus, profágová typizace, hybridizace restrikčních spekter se směsí profágově specifických sond

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 22. 5. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 13. 6. 2006
• Vedoucí: doc. RNDr. Roman Pantůček, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární biologie a genetika