Optimalizace rychlého imunoblotingu proteinů na přístroji SNAP i.d. pro rostlinné vzorky

Jolana GEORGIADISOVÁ

Bachelor's thesis

Optimization of rapid protein immunoblotting on SNAP id. system for plant samples

Abstract:

Mezi nejdůležitější metody analýzy proteinů patří elektroforéza v polyakrylamidovém gelu a blotování. Při SDS-PAGE elektroforéze dochází k rozdělení proteinů v polyakrylamidovém gelu. Z mobilní fáze (gel) jsou proteiny přeblotovány pomocí Western blotingu na pevný nosič (membrána). Důležitou roli hraje typ membrány. Přeblotovaná membrána je inkubována klasickým a zdlouhavým postupem na třepačce s příslušnou primární a sekundární protilátkou. Inkubační doba může trvat 4 hodiny a více. Proto byl vyvinut přístroj SNAP i.d., na kterém se blokování membrány a inkubace s protilátkami sníží na pouhých 30 minut. Je to velmi rychlá a účinná metoda analýzy proteinů. Experimentální část se zabývala optimalizací metody rychlého imunoblotingu na přístroji SNAP id. na modelovém proteinu nitrovaném hovězím sérovém albuminu. Byly porovnány vhodná ředění vzorku a protilátek (primární, sekundární), různé typy membrán a metody vizualizace výsledků. Nejvhodnější membránou byla nitrocelulosová, optimální výsledky byly získány s králičí protilátkou při ředění 1:1000 a sekundární 1:5000. Značení sekundární protilátky křenovou peroxidasou a následná detekce chemiluminiscence na citlivý fotopapír byla nejcitlivější metodou. Optimalizovaný postup blotingu byl aplikován na analýzu extraktů z Arabidopsis thaliana. Byla prokázána vhodnost optimalizované metody pro sledování a kvantifikaci nitrovaných proteinů v rostlinách.

Abstract:

SDS-PAGE electrophoresis belongs to the most important method of protein analysis in which proteins are separated in polyacrylamide gels. Proteins are transferred from a mobile phase (gel) by Western blotting to a solid support (membrane). The type of membrane plays an important role. Blotted membrane is incubated on a shaker by a classical and time-consuming procedure with an appropriate primary and secondary antibody. The incubation time can last four and more hours so that is why the SNAP i.d. protein detection system was developed. Time for blocking of membrane and incubation with antibodies is reduced to 30 minutes. SNAP i.d. is a very fast and effective method for protein analysis. The practical part is focused on the optimization of method of rapid immunoblotting on a SNAP i.d. using as model protein nitrated bovine serum albumin. Different dilutions of sample and antibodies (primary, secondary), various types of membranes and methods for visualization results were compared. The nitrocellulose membrane was the most suitable; the optimal results were obtained with a rabbit antibody diluted 1:1000 and secondary antibody diluted 1:5000. The most sensitive method included the use of secondary antibody labelled with horseradish peroxidase with subsequent chemiluminescence detection on a sensitive photographic paper. The optimized process of blotting was applied to the analysis of extracts from Arabidopsis thaliana. The optimized method showed the suitability of the monitoring and quantification of nitrated proteins in plants.

Keywords

Western bloting, rychlý imunobloting, SNAP id., nitrované proteiny

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2012

Accessible from:: 9. 5. 2012

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Marek Petřivalský, Dr.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry