Konstrukce fyzické mapy krátkého ramene chromozómu 7D pšenice a její využití pro poziční klonování

Mgr. Helena STAŇKOVÁ

Doctoral thesis

Abstract:

Bread wheat (Triticum aestivum L.) is one of the most important crop species providing the staple food for 30 % of the world's population. Despite of that, wheat genome research, namely genetic and physical mapping, sequencing and positional cloning, are significantly hampered by the huge genome size (~17 Gb), presence of three homoeologous subgenomes and prevalence of repetitive DNA sequences (>80 %). Those obstacles can be overcome by dissecting the genome into particular chromosomes or chromosome arms by flow-cytometric sorting. Dividing the genome into small defined parts makes the production of the reference genome sequence a feasible task. This work focuses on the study of the short arm of the chromosome 7D (7DS) of wheat. Within the framework of the thesis, the physical contig map of the 7DS arm was constructed and sequencing of a minimal tilling path (MTP) was performed. This represents a crucial step towards the completion of the reference sequence of the 7DS. To validate the physical map assembly, sequences of MTP BAC clones were compared with the BioNano genome map constructed for the 7DS arm using Irys platform. The comparison proved that this novel genome mapping technology provides a useful tool for validation and improvement of the physical map assembly. It also holds a potential for studying tandem repeats and supporting a pseudomolecule construction. The short arm of the chromosome 7D carries several agronomically important genes, including a Russian wheat aphid resistance gene Dn2401. The second part of the theses focuses on the positional cloning of this resistance gene. With the aim to construct a high density genetic map covering the gene region, which is a prerequisite for the positional cloning, a new method for targeted marker development in a hexaploid wheat genome was introduced. Employing this approach, several new markers closely linked to the gene have been developed. This enabled to identify a BAC contig in the 7DS-specific physical map spanning the Dn2401 region. Sequencing and annotation of the constituting BAC clones revealed several candidate genes. The availability of the physical contig map as well as MTP BAC clone sequences facilitated significantly the positional cloning process.

Abstract:

Pšenice setá (Triticum aestivum L.) představuje jednu z nejvýznamnějších zemědělských plodin, jež poskytuje potravu pro 30% světové populace. Studium genomu pšenice, zejména pak genetické a fyzické mapování, sekvenování a poziční klonování, je ztíženo značnou velikostí genomu (~17 Gb), přítomností tří homeologních subgenomů a převahou repetitivních sekvencí (>80 %). Řešení těchto problémů nabízí třídění jednotlivých chromozómů a jejich ramen pomocí průtokové cytometrie. Toto rozdělení genomu na malé přesně definované části je nezbytným krokem k získání referenční sekvence genomu pšenice. Předkládaná práce se zabývá studiem krátkého ramene chromozómu 7D (7DS). V rámci práce byla zkonstruována fyzická kontigová mapa ramene 7DS. Ta posloužila k výběru tzv. minimal tilling path (MTP), tedy minimální sestavy klonů z knihovny dlouhých inzertů, která reprezentuje celé chromozómové rameno. Klony z MTP byly následně sekvenovány a získaná data se stala základem pro sestavení referenční sekvence ramene 7DS. Za účelem ověření správnosti fyzické mapy a tedy i výsledné chromozómové sekvence bylo provedeno srovnání s genomovou mapou vytvořenou technologií BioNano na platformě Irys. Toto srovnání prokázalo, že genomová mapa může posloužit jako užitečný nástroj pro ověřování a zdokonalení fyzické mapy a má také potenciál uplatnit se při analýze tandemových repetitivních sekvencí. Zmíněná technologie může dále poskytnout jeden z podpůrných nástrojů pro sestavení pseudomolekuly, tedy kontinuální sekvence celého chromozómového ramene. Krátké rameno chromozómu 7D nese několik genů pro agronomicky významné znaky, mezi nimi i gen Dn2401, jenž podmiňuje rezistenci k mšici zhoubné. Druhá část předkládané práce je věnována pozičnímu klonování uvedeného genu. Jedním ze základních kroků v procesu pozičního klonování je konstrukce vysokohustotní genetické mapy pro oblast klonovaného genu. S cílem zahustit genetickou mapu byl navržen postup pro cílený vývoj markerů v prostředí hexaploidního pšeničného genomu. Za použití této metody bylo vyvinuto několik nových markerů v těsné vazbě na gen. Pomocí nově vyvinutých markerů byl identifikován kontig fyzické mapy, jenž překlenuje oblast genu. Sekvenování a následná anotace sekvencí klonů ze získaného kontigu odhalila přítomnost několika kandidátních genů. Dostupnost fyzické kontigové mapy a sekvencí jednotlivých klonů z MTP značně zjednodušila proces pozičního klonování.

Keywords

pšenice setá (Triticum aestivum), fyzická kontigová mapa, sekvenování, genetické mapování, poziční klonování

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 11. 2015

Accessible from:: 13. 11. 2015

Thesis defence

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology / Botany