Příprava multiproteinových komplexů mezi CTD a CID pro měření pomocí SAXS

Mgr. Jakub Macošek

Bachelor's thesis

Preparation of CTD:CID multiprotein complexes for SAXS studies

Anotácia:

Největší podjednotka eukaryotické RNA polymerasy II (RNAPII) obsahuje neobvyklou C-terminální doménu (CTD) tvořenou tandemovými repeticemi heptapeptidu Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7. CTD podléhá v průběhu transkripce dynamické fosforylaci. Takto modifikovaná CTD je in vivo rozpoznávaná proteinovými faktory zapojenými ve zpracování RNA či regulaci transkripce. Prostřednictvím těchto interakcí dochází k funkčnímu propojení zpracování RNA a regulace transkripce s transkripcí samotnou. Několik faktorů, které se podílejí na zpracování 5' a 3' konce či terminaci transkripce, rozpoznává CTD fosforylované na určitém serinu prostřednictví CTD-interakční domény (CID). Interakce CID s CTD o dvou repeticích jsou strukturně dobře popsány, nicméně informace o efektech těchto interakcí na strukturu CTD v plné délce chybí. Pro účely strukturního studia homogenně fosforylované CTD byl v naší laboratoři vyvinut systém mimikující fosforylaci pomocí substituce serinu kyselinou glutamovou. Zde prokazujeme, že CID jsou schopny rozpoznávat fosfomimikující CTD (pmCTD) specificky a se srovnatelnou afinitou jako fosforylované CTD (pCTD). Pro další studia CTD pomocí Small-angle X-ray scattering jsme provedli optimalizaci přípravy pmCTD:CID komplexů pomocí cross-linkování glutaraldehydem a formaldehydem. Další optimalizace a kombinování těchto metod s NMR studiemi by měla napomoci lépe pochopit změny struktury CTD, ke kterým dochází při vazbě více proteinových faktorů.

Abstract:

The largest subunit of eukaryotic RNA polymerase II (RNAPII) possesses unusual C- terminal domain (CTD), which consists of multiple tandem repeats of consensus sequence Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7. During the transcription cycle CTD is dynamically phosphorylated. The CTD phosphorylation is specifically recognized in vivo by protein factors involved in RNA processing and transcription regulation. These protein-protein interactions functionally link RNA processing and transcription regulation with transcription. Several of the RNA processing factors that facilitate both 5’ and 3’ processing and transcription termination specifically recognize CTD phosphorylated at certain serine by their CTD-interacting domains (CIDs). Interactions of CIDs with two repeats of CTD are structurally well described, but the effects of the interactions on the full length CTD structure is not understood. To prepare large amounts of homogeneously modified CTD for structural studies a system using serine substitutions to glutamic acid to mimic phosphorylation was previously developed in our laboratory. Here we show that CIDs are able to recognize phosphomimicking CTD (pmCTD) specifically with comparable affinity to phosphorylated CTD (pCTD). For further studies of CTD using Small-angle X-ray scattering we optimized preparation of pmCTD:CID complexes by glutaraladehyde and formaladehyde cross-linking. Further optimization and combination of the described methods with solution NMR studies should provide better understanding of the changes in CTD structure upon binding with multiple protein factors.

Keywords

RNA polymerase II, C-terminal domain, CTD, CTD-interacting domains, pull-down, cross-linking, fluorescence anisotropy, RNA processing, transcription, C-terminální doména, CTD-interakční domény, fluorescenční anisotropie, RNA polymerasa II, zpracování RNA, transkripce

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 19. 6. 2013
• Vedúci: doc. Mgr. Richard Štefl, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry