Sledování účinku inhibice mTOR signalizační dráhy na pregnanový X receptor.

Bc. Nikola JURAČKOVÁ

Master's thesis

The effect of mTOR signalling pathway inhibition on the function of pregnane X receptor.

Abstract:

Pregnanový X receptor (PXR) je významným regulátorem exprese širokého spektra enzymů, které se přímo podílejí na biotransformaci nebo exkreci xenobiotik a je tak považován za jeden z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících farmakokinetiku mnoha léčiv prostřednictvím eliminačních procesů. Aktivita tohoto receptoru je významně ovlivňována jak vazbou ligandu, tak i jeho post-translačními modifikacemi a asociací s koregulátory transkripce. Významnou roli v buněčné signalizaci hraje dráha mTOR, která po aktivaci reguluje mnohé základní pochody v buňce. Fosforylací svých substrátů navozuje změny, které ovlivňují energetický metabolismus, proliferaci a růst buňky, autofagii a apoptózu. Tato práce se zaměřila na vliv rapamycinu, inhibitoru mTORC1, na aktivitu PXR a následnou expresi jeho cílových genů CYP3A4 a ABCB1. Nejprve byla sledována schopnost PXR aktivovat promotor enzymu CYP3A4 metodou Reporter gene assay v buněčné linii HEK293T. Poté byla sledována exprese genů CYP3A4 a ABCB1 na úrovni mRNA a proteinů metodami qRT-PCR, SDS-PAGE a immunoblotingu v buněčné linii LS174T. Rapamycin (Rap) byl aplikován ve dvou netoxických koncentracích buď samostatně, nebo v kombinaci s aktivátorem PXR rifampicinem (Rif). Tato kombinace látek výrazně snižovala transkripční aktivitu PXR a také hladinu CYP3A4 mRNA. Hladina exprese mRNA ABCB1 nevykazovala nijak významné změny, avšak na úrovni proteinu byl stanoven výrazný pokles po aplikaci Rap s Rif. Výsledky naznačují, že mTOR kináza významně ovlivňuje signalizaci PXR v přítomnosti jeho aktivátoru rifampicinu.

Abstract:

Pregnane X receptor is an important expression regulator of wide variety of enzymes which play key roles in a biotransformation and excretion of xenobiotics. Through elimination processes, PXR is considered as one of the most important factor affecting pharmacokinetics of many drugs. An activity of this receptor is influenced by a ligand binding post-translational modifications and association with transcriptional coregulators. Mammalian TOR signalling pathway plays an important role in a cell signalling and activation of this pathway leads to regulation of many principal processes in the cell. Phosphorylation of mTOR substrates induces changes which affect an energymetabolism, proliferation, cell growth, autophagy and apoptosis. This thesis focused on the influence of selective inhibitor of mTORC1, rapamycin, on the PXR activity and the PXR-target genes CYP3A4 and ABCB1 expression. By using a Reporter gene assay was monitored the ability of PXR to activate CYP3A4 promoter in HEK293T cell line. After that the expression of CYP3A4 and ABCB1 of mRNA and proteins was monitored by qRT-PCR, SDS-PAGE and immunoblotting in LS174T cell line. Rapamycin (Rap) was used in two nontoxic concentrations and also in combination with rifampicin (Rif) an activator of the PXR. This combination significantly reduces the PXR transcriptional activity and mRNA CYP3A4 quantity. Even though the expression of mRNA ABCB1 did not change, the application of Rap in combination with Rif significantly reduced the level of protein. The results suggest the mTOR kinase affects PXR signalisation in presence of rifampicin.

Keywords

Biotransformace, Cytochrom P450, pregnanový X receptor, posttranslační modifikace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2016

Accessible from:: 27. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Aneta Vávrová, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology