Porovnání metod pro stanovení glutathionu v biologickém materiálu

Bc. Kateřina Davidová

Diplomová práce

Comparison of assays to measure glutathione levels in biological material

Anotace:

Glutathion je tripeptid, složený z glycinu, cysteinu a kyseliny glutamové. Jedná se o nízkomolekulární antioxidant, který má mnoho důležitých funkcí. V buňkách je přítomen v oxidované (GSSG) nebo redukované formě (GSH). V současné době existuje mnoho metod ke stanovení GSH i GSSG. Cílem naší práce bylo využít a porovnat dvě metody využívající o-ftaldialdehyd (OPA) a monochlorobiman (MCB) při stanovení GSH v různých druzích biologického materiálu. Při stanovení GSH v myších jaterních homogenátech byla zjištěna velmi silná korelace mezi použitými metodami (r = 0,94). Absolutně vyjádřené koncentrace GSH neředěných homogenátů byly vyšší u OPA metody. Absolutně vyjádřené koncentrace GSH u homogenátů ředěných 10x deionizovanou vodou byly podobné u obou metod, v některých případech byly vyšší u MCB metody. Před stanovením GSH v buňkách periferní krve byly optimalizovány podmínky stanovení. U obou metod bylo optimalizováno ředění krve. U MCB metody byla navíc optimalizována aktivita glutathion-S-transferázy (GST) a excitační vlnová délka. Metody mezi sebou velmi dobře korelovaly (r = 0,91). Absolutně vyjádřené koncentrace GSH byly vyšší u MCB metody. V poslední části naší práce byly pomocí obou metod stanovovány koncentrace GSH v kultivovaných buňkách A549 a HK-2. Korelační koeficient byl v tomto případě také velmi vysoký (r = 0,97). Absolutně vyjádřené koncentrace GSH byly vyšší u OPA metody. Rozdíly v absolutně vyjádřených koncentrací GSH byly pravděpodobně způsobeny dodatečně přidanou GST, která katalyzovala rychlou a specifickou reakci mezi MCB a GSH. GST byla přidána do vzorků periferní krve, proto mohly být absolutně vyjádřené koncentrace GSH vyšší právě u MCB metody. Naopak v případě jaterních homogenátů a kultivovaných buněk nebyla GST přidána.

Abstract:

Glutathione is a tripeptide consisting of glycine, cysteine and glutamic acid. It is a low molecular weight antioxidant that has many important functions. It is present in oxidized (GSSG) or reduced (GSH) forms in cells. Currently, there are a number of methods determining GSH and GSSG. The aim of our work was to use and to compare two methods using o-phthaldialdehyde (OPA) and monochlorobimane (MCB) determining GSH in various biological material. When GSH was determined in mouse liver homogenates, a very strong correlation was found between used methods (r = 0.94). Absolute concentrations of GSH in undiluted homogenates were higher in the OPA method. Absolutely expressed concentrations of GSH in homogenates diluted 10x with deionized water were similar for both methods, in some cases higher in the MCB method. Before the determination of GSH in peripheral blood, the assay conditions were optimized. Dilution of blood was optimized for both methods. In addition, the activity of glutathione-S-transferase (GST) and excitation wavelength were optimized in MCB method. The methods correlated each other strongly (r = 0.91). Absolute concentrations of GSH were higher in the MCB method. In the last part of our work, the concentrations of GSH were determined in cultured A549 and HK-2 cells. The correlation coefficient was also very high in that case (r = 0.97). Absolutely expressed concentrations of GSH were higher when used the OPA method. The differences between absolutely expressed concentrations of GSH in both methods were likely caused due to the addition of GST, which catalyzed a rapid and specific reaction between MCB and GSH. The GST was added to samples of peripheral blood, therefore absolutely expressed concentrations of GSH were higher in the MCB method. Conversely, in the case of liver homogenates and cultured cells, GST was not added.

Klíčová slova

glutathion, stanovení glutathionu, o-ftaldialdehyd, monochlorobiman, jaterní homogenát, periferní krev, buněčná kultura

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 5. 2018

Zveřejnit od: 31. 12. 2999

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. RNDr. Tomáš Roušar, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Bioanalytik