Isolation of early stages of germ cells in pikeperch (\kur{Sander lucioperca})

Ege GÜNGÖR

Master's thesis

Abstract:

A practical technique for enzymatic dissociation and isolation of pikeperch (Sander lucioperca) (Percidae, Teleostei) early stage germ cells (eGC), including spermatogonia and spermatocytes, is reported in this study. Their potential to differentiate into functional gametes, and transmit genetic information to the next generations makes them suitable for cryopreservation and surrogate reproduction studies by germline chimera. Two different age groups (14 month old and 18 month old) of pikeperch were used to adjust the correct stage of eGC isolation. Finally the 18 month old samples were selected due to their high average gonadal volume (0.513 g). 10 ml PBS + 0.3% trypsin (304 mOsm/kg, pH 8) were used for enzymatic dissociation of testicular cells and they were sorted by centrifugation in Percoll density gradient. eGCs were identified on the basis of their ploidy level by CYSTAIN DNA 1 steps kit (PARTEC) and morphological characteristics trough by light microscopy. Cell counting was performed on histological sections and Percoll gradient layers whit the method of random square counting. The method of isolation enriched the number of eGC from 41.3% to 84.7%, obtained from the 33% of Percoll concentration.

Abstract:

Tato studie popisuje techniku enzymatické disociace a izolace raných stádií zárodečných buněk (eGC), zahrnující spermatogonie a spermatocyty candáta obecného (Sander lucioperca) (Percidae, Teleostei). Jejich potenciál diferencovat se do funkčních gamet a přenášet genetickou informaci do dalších generací z nich dělá vhodného kandidáta pro kryoprezervaci a tvorbu chimér. Pro zvolení vhodného věku pro izolaci byly testovány dvě skupiny candátů lišící se věkem (14 a 18 měsíců stáří). Díky vyšší průměrné hmotnosti gonád (0,513 g) se jako vhodnější ukázali 18 měsíční samci candáta obecného. Pro enzymatickou disociaci testes bylo použito 10 ml PBS s 0,3% trypsinu (304 mOsm/kg, pH 8). Testikulární buňky byly následně tříděny centrifugací v hmotnostním gradientu Percollu. eGCs byly identifikovány na základě jejich ploidní úrovně s použitím CYSTAIN DNA 1 kitu (PARTEC) a morfologických charakteristik s použitím světelné mikroskopie. Buňky byly počítány na histologických řezech a po použití Percoll gradientu metodou náhodných čtverců. Metoda izolace zvýšila zastoupení eGC ze 41,3% na 84,7% získané z 33% koncentrace Percollu.

Keywords

zárodečné buňky, Percoll gradient, průtoková cytometrie, enzymatická disociace, candát obecný

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 6. 2015

Accessible from:: 3. 6. 2015

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Martin Pšenička, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Master programme / field:
Zootechnics / Aquaculture