Výskyt mikrosporidií u hematologických a onkologických pacientů

Veronika DORAZILOVÁ

Bakalářská práce

The incidence of microsporidium in hematological and oncological patients

Anotace:

Mikrosporidie jsou intracelulární parazité patřící do říše hub. Existuje asi 1200 druhů mikrosporidií rozdělených do 150 rodů, pro člověka je nejvýznamnějších 14 druhů. Nejčastěji způsobuje infekce u člověka druh Enterocytozoon bieneusi, dále Encephalitozoon intestinalis Infekčním stádiem mikrosporidie je spora, což je oválný útvar umožňující infikování hostitele. Spora obsahuje tzv. pólové vlákno, které je vnějšími podmínkami vymrštěno do cytoplazmy hostitele a uvolňuje se obsah zvaný sporoplasma. Poté následuje vývoj mikrosporidie v hostiteli, který probíhá dvěma fázemi vývoje ? merogonií, při níž dochází k dělení plasmodia na meronty až do zaplnění buňky, a sporogonií, kdy se jednotlivé buňky osamostatňují a prochází jednotlivými stádii vývoje až do vzniku spory. Mikrosporidiózou se člověk může nakazit fekálně orálním přenosem, a to požitím kontaminované vody či špatně tepelně upraveného masa. Tento druh přenosu se nazývá horizontální. Druhým typem přenosu, který nebyl u lidí popsán, je vertikální (transplacentární přenos). Dále může být významný také zoonotický přenos. Člověk se může nakazit mikrosporidiózou od nejrůznějších druhů živočichů, kteří byli infikováni jednotlivými druhy mikrosporidií. Ohroženou skupinou jsou především pacienti se získanou primární imunodeficiencí, dále mohou být nakaženy děti, starší osoby, pacienti po transplantaci či cestovatelé. Mikrosporidie způsobují oportunní infekce, pro něž je charakteristické, že doprovázejí jiná primární onemocnění, například AIDS, virové či bakteriální onemocnění a mnoho dalších. Mezi nejčastější klinické projevy patří zejména průjem, dalšími příznaky mohou být i oční, plicní či svalové potíže. Cílem mé práce bylo zjistit přítomnost či nepřítomnost čtyř druhů mikrosporidií, Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon hellem, Encephalitozoon cuniculi a Enterocytozoon bieneusi, ve vzorcích stolice hematologických a onkologických pacientů a výsledky porovnat s již získanými výsledky. Celkem jsem nasbírala 45 vzorků stolice v období leden 2012 ? leden 2013. Vzorky byly odebírány do nesterilních uzavíratelných nádobek a zpracovány v laboratořích parazitologii v AV ČR v Českých Budějovicích. Následně jsem všechny vzorky zpracovala metodou barvení Calcofluor white a preparáty pozorovala pod mikroskopem Olympus IX 70. Hledala jsem oválné jasně modrobíle zářící spory mikrosporidií. Bylo nutné je odlišit od kvasinek. Další metodou zpracování byla molekulární diagnostika. Všech 45 vzorků jsem vyizolovala pomocí komerčního kitu PSP Spin Stool DNA kit (INVITEK). Principem izolace bylo rozbití spor a získání čisté DNA vhodné k dalšímu zpracování. Následně jsem provedla polymerázovou řetězovou reakci, což je metoda využívající rychlého zmnožení DNA založena na principu replikace nukleových kyselin. PCR probíhala v temocyklerech (BIO RAD, BIOER) po dobu dvou hodin. Amplifikace probíhala v opakujících se cyklech, složených ze tří základních kroků ? denaturace, hybridizace a elongace. Následujícím krokem byla gelová elektroforéza. Výsledek elektroforézy byl zobrazován pomocí transluminátoru, který byl propojen s počítačem. Podle délky fragmentů bylo určeno, zda se jedná o přítomnost jednoho ze čtyř výše uvedených druhů mikrosporidií ve vzorku. Jelikož se potvrdila přítomnost mikrosporidií, dalším krokem byla extrakce DNA z gelu. Vyizolovaná čistá DNA byla poté zaslána na sekvenaci. Celkem bylo na sekvenaci zasláno 9 fragmentů DNA. Posledním krokem byla analýza prováděná v biologickém centru AV ČR v Českých Budějovicích, která určila, o jaký genotyp se jedná. Byla potvrzena přítomnost druhu Encephalitozoon cuniculi, genotyp II

Anotace:

u jednoho hematologického pacienta. Dále byla potvrzena přítomnost druhu Enteocytozoon bieneusi, genotyp D u dvou hematologických pacientů a u šesti onkologických pacientů.

Abstract:

Microsporidia are intracellular parasites belonging to the Fungi kingdom. There are about 1200 species of microsporidia in 150 genera, 14 species of microsporidia are the most important for human. Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon intestinalis are the most common microsporidian, that cause infections in humans. Infectious stages of microspoidia are spores. They are oval shape and serve for host infection. Spore contains the polar tube, which is ejecting into cystoplasm of the host cell. The process is triggered by external conditions and release the content called sporoplasma into host cell. The development of microsporidia in the host follow, which includes two phases of development - merogony, which involves division of the plasmodium on meronts and sporogony, when individual cells become independent and after variol stages of development finishes by the spore formation. Microsporidiosis can be transmitted by fecal oral transmission: ingestion of contaminated water or poorly cooked meat. This type of transmission is called horizontal. The second type of transmission is vertical transmission (transplacental), which wasn´t been described in humans. Zoonotic transmission can be important, too. A person can be infected by microsporidiosis from various species of animals that were infected with different species of microsporidia. Patients with acquired primary immunodeficiency are the group at risk. Children, senior patients, travelers or patietns after transplantation can be infected, too. Microsporidia cause opportunistic infections for which is characteristic that accompany other primary diseases, such as AIDS, other viral or bacterial diseases and so on. The most common clinical manifestations include diarrhea, other symptoms are eye, lung or muscle problems. The aim of this work was determine the presence or absence four species of microsporidia, Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon hellem, Encephalitozoon cuniculi and Enterocytozoo nbieneusi in faecal samples of hematology and oncology patients and compare the results with the results already described. I collected 45 stool samples during the period January 2012 - January 2013. Samples were collected in non-sterile cap bottles and processed in parasitological laboratory in AS CR in České Budějovice. Then I stained all samples by the calcofluor white and examined with the microscope Olmypus IX70. I was looking for oval bright blue-white spores of microsporidia. It was necessary to distinguished from yeasts. Another method was molecular diagnostics. I isolated DNA from all 45 samples using a commercial kit PSP Spin Stool DNA kit (INVITEK). During isolation spores were desintegrated and DNA suitable for further processing obtained. Then I performed polymerase chain reaction, a method using a rapid multiplication of DNA based on the principle of replication of nucleic acids. PCR was performed in thermocycler (BIO RAD, BIOER) for two hours. Amplification was carried out in 35 repetitive cycles of three basic steps - denaturation, hybridization and elongation. Gel electrophoresis was next step. There result was shown by electrophoresis transluminator, which was connected with a computer. According to the fragment length was determined whether one of the four above-mentioned species of microsporidia is present in the sample. DNA extraction from gel was next step, if presence of microsporidia was comfirmed. Then the purified DNA was send to sequencing to Korea and sequences were evaluated. Total nine DNA fragments were send to sequencing. Next analyses was last step. This was carried in out in the biological center of AS CR in České Budějovice. Phylogenetic analyses determined type of genotype. Presence of the species Encephalitozoon cuniculi, genotype II in one hematologic patient was confirmed. Also, presence of the species Enterocytozoon bieneusi, genotype D in two hematologic patients and six hematologic patients was confirmed.

Klíčová slova

oportunní mikrosporidiózy, hematologičtí a onkologičtí pacienti, radioterapie, chemoterapie, diagnostika

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 3. 5. 2013

Zveřejnit od: 3. 5. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. RNDr. Oleg Ditrich, CSc.

JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH

Zdravotně sociální fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Specializace ve zdravotnictví / Zdravotní laborant