Charakterizace histonů v rostlinných organizmech

Bc. Jan Bílek

Master's thesis

Characterization of histones in plant organisms

Abstract:

Histony jsou konzervované molekuly, které se vyskytují napříč eukaryotními organizmy. Většina histonů má i své specifické sekvenční varianty. Společně s posttranslačními modifikacemi, jako jsou metylace či acetylace, mohou ovlivňovat výrazným způsobem genovou expresi. Znalost epigenetických procesů, se kterými jsou his-tony úzce spjaty, je nutná k pochopení mechanismů ve vývoji rostlin a jejich obranyschopnosti. Diplomová práce se zabývá charakterizací rostlinných histonů a jejich rolí v dynamice chromatinu. Teoretická část práce se věnuje dynamice histonů v chromatinu, jejich sekvenčním variantám a posttranslačním modifikacím. Rovněž jsou zde stručně popsány vybrané metodické přístupy, kterými lze studovat dynamiku chromatinu, resp. i histony. Praktická část je složena ze tří experimentů, které zahrnují izolaci histonových variant H3.1 a H3.3 z Arabidopsis thaliana. Tyto dvě varianty se v primární struktuře mezi sebou liší pouze čtyřmi aminokyselinami. Histony H3.1 a H3.3 byly fúzovány s epitopovou značkou Myc-tag, prostřednictvím které byly izolovány imunoprecipitací. Tento proces byl následně evaluován pomocí LC MS/MS, SDS-PAGE a Western blot. Původní premisou experimentu byl zisk histonové varianty s navázanou epitopovou značkou. V případě vysoké specifity by tak bylo možné prostřednictvím LC-MS/MS charakterizovat specifický profil posttranslančních modifikací u dané varianty. Výsledky však poukázaly na nedostatečnou specifitu a protokol izolace bude nutné dále optimalizovat.

Abstract:

Histones are conserved proteins that occur among eukaryotic organisms. Most of the histones have their specific sequence variants. Together with post-translational modifications, such as methylation or acetylation, they can significantly influence gene expression. Knowledge of epigenetic processes is necessary for understanding plant development and defence mechanisms. This thesis aims to characterize plant histones and their role in chromatin dy-namics. The theoretical part of the study explores histone dynamics in chromatin, histone sequence variants, and their post-translational modifications. Selected methodological approaches for studying histones and chromatin dynamics are also described. The practical part has three experiments that involve the isolation of histones variants H3.1 and H3.3 from Arabidopsis thaliana. These variants differ by only four amino acids in their primary structure. Histones H3.1 and H3.3 were fused to epitope Myc tag, through which they were isolated by immunoprecipitation. The isolation process was evaluated by LC-MS/MS, SDS-PAGE, and Western blotting. The premise of the experiment was to obtain histone variant with Myc tag. In the case of high specificity, it would enable characterization of the post-translational profile of respective histone variant by LC-MS/MS. However, the results obtained revealed insufficient specificity of immunoprecipitation. Thus, the isolation protocol will be further optimalized.

Keywords

Histony, histon H3.1, histon H3.3, Arabidopsis, chromatin, posttranslační modifikace, imunoprecipitace, Myc-tag, LC MS/MS, Histones, histone H3.1, histone H3.3, post-translational modification, immunoprecipitation

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 5. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 15. 6. 2023
• Supervisor: Mgr. Gabriela Lochmanová, Ph.D.
• Reader: Mgr. Lucie Bozděchová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry