Kvantifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie

Bc. Eva Srbová

Diplomová práce

Protein quantification by mass spectrometry

Anotace:

Dimethylace je účinná metoda relativní kvantifikace hmotnostní spektrometrií, která využívá značení stabilními izotopy. Probíhá jednoduchým mechanismem, kdy reaguje formaldehyd s N-koncem nebo postranním řetězcem lysinu a vzniká Schiffova báze, která je redukována kyanoborohydridem sodným. Kombinací těchto sloučenin – izotopicky značených a neznačených – lze kvantifikovat až pět vzorků najednou. V této práci byla dimethylace použita ve spojení s metodou přípravy vzorku FASP, která využívá „cut off“ filtry pro separaci proteinů od nízkomolekulárních látek s následným štěpením proteinů trypsinem přímo na filtru. Naštěpené peptidy jednotlivých vzorků jsou následně naznačeny příslušnou značkou, smíchány a kvantifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie. Cílem této práce bylo porovnat variabilitu jednotlivých kroků při zpracování vzorku před samotnou hmotnostně spektrometrickou analýzou. Naše výsledky prokázaly, že zásadním zdrojem variability není dimethylace, ale příprava biologických replikátů.

Abstract:

Dimethylation is an effective method for relative quantification mass spectrometry, which uses stable-isotope labeling. The mechanism is simple, formaldehyde reacts with the N-terminus or a side chain of lysine to form Schiff base, which is reduced by sodium cyanoborohydride. By combination of these isotopically labeled and non-labeled compounds – up to five samples can be quantified simultaneously. In this work dimethylation was used in conjunction with the method of sample preparation FASP, which uses the "cut off" filters to separate proteins frow low molecular weight compounds and on filter protein digestion with trypsin. The digested peptides of particular samples are labeled by selected tag, samples are pooled and then quantified by mass spectrometry. The aim of this study was to assess variability of sample processing steps prior to the mass spectrometric analysis. Our results have shown that the major source of variability is not dimethylation, but the preparation of biological replicates.

Klíčová slova

proteomika, hmotnostní spektrometrie, ESI MS, relativní kvantifikace, dimethylace proteomics, mass spektrometry, relative quantification, dimethylation

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 20. 5. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 6. 2013
• Vedoucí: doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Analytická biochemie