NMR studium rostlinných histidinkinas

Bc. Dominik Hrebík

Master's thesis

NMR study of plant histidine kinases

Abstract:

V tejto diplomovej práci bola študovaná signálna dráha známa ako viacstupnňvá fosforylácia v rastline Arabidopsis thaliana. Tento signálny systém slúži ako mechanizmus ktorý dovoľuje organizmom zachytiť a odpovedať na zmeny vonkajšieho prostredia. Tento signálny systém je založený na prenose fosfátu kaskádou proteínov lokalizovaných v membráne, cytozole a jadre. V rastline Arabidopsis thaliana po prijatí signálu sa fosforyluje histidínová kináza a nesie fosfátovú skupinu cez histidín fosfotransférové proteíny do regulacného proteínu lokalizovaného v jadre, ktorý vykoná odozvu. Kyselina asparágová 1050 prítomná v aktívnom centre senzorovej histidínovej kinázy CKI1RD hrá dôležitú rolu v tejto signálnej dráhe. Toto residuum naväzuje fosfát a prenáša ho na Arabidopsis hitidínové fosfotransférové proteíny (AHPs). Wild-type proteín CKI1RD a dva CKI1RD proteíny s mutáciami v ich aktívnych centrách CKI1RD - D127A a CKI1RD - D127E boli exprimované v E.coli, znacené stabilným izotopom 15N a študované NMR relaxacnými experimentmi. Výsledky ukázali, že mutácia katalytickej kyseliny asparágovej nemá na dynamiku dramatický vplyv. Malé zmeny boli pozorované iba pre pohyby na μm-ms časovej škále.

Abstract:

The signaling pathway known as the multistep phosphorelay signaling system in the plant Arabidopsis thaliana was studied in this diploma thesis. The multistep phosphorelay signaling system serves as a mechanism allowing organisms to sense and respond to changes in many environmental conditions. This signaling system is based on phosphate transfer in a cascade of proteins localized in membrane, cytosole, and nucleus. In the plant Arabidopsis thaliana, histidine kinase is phosphorylated upon signal recognition, and forwards the phosphate group through histidine phosphotransfer proteins to a response regulator protein located in nucleus, where the response takes place. Aspartic acid 1050 present in the active centre of the sensor histidine kinase CKI1RD plays an important role in the signaling pathway. This residue binds phosphate and transfers it to the Arabidopsis histidine phosphotransfer proteins (AHPs). Wild-type protein CKI1RD and two CKI1RD proteins with mutations in their active sites (CKI1RD - D127A and CKI1RD - D127E) were expressed in E.coli and labelled by stable isotope 15N and studied by NMR relaxation experiments. The results showed that mutation of the catalytic aspartate does not affect dynamics dramatically. Small differences were observed only for motions at the μm-ms timescale.

Keywords

CKI1RD, multistep phosphorelay, NMR relaxation, protein dynamics, spectral density mapping, model free, nuclear magnetic resonance, histidine kinase, Arabidopsis thaliana, protein mutants CKI1RD, viacstupňová fosforylácia, NMR relaxácie, proteínová dynamika, mapovanie funkcie spektrálnej hustoty, nukleárna magnetická rezonancia, histidínová kináza, proteínové mutácie

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 5. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 25. 6. 2015
• Supervisor: prof. Mgr. Lukáš Žídek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biomolecular Chemistry