Detekce vybraných CD molekul v savčích spermiích

Daniela Spěváková

Master's thesis

Detection of selected CD molecules in mammalian spermatozoa

Anotácia:

CD molekuly jsou antigeny přítomné v buněčných membránách imunitního systému, nicméně byly detekovány i na tkáních a buňkách reprodukčního traktu, a to včetně gamet, kde se mohou účastnit událostí vedoucích k jejich fúzi. Předkládaná práce je zaměřena na dvě CD molekuly patřící do rodiny proteinů regulujících komplement – CD46 a CD52. U proteinu CD46 se předpokládá jeho role při fúzi gamet, případně by mohl mít důležitou funkci při stabilizaci akrozomu. Protein CD52 je označován jako antigen asociovaný s maturací spermie. Prvním cílem této diplomové práce byla lokalizace proteinů CD46 a CD52 v kančích a býčích spermiích a detekce těchto proteinů v reprodukčních orgánech kance a ve spermiích obou druhů pomocí imunofluorescenčních a imunodetekčních metod. Dalším cílem bylo sledování exprese genů pro uvedené proteiny v testikulární a epididymální tkáni kance. Data byla statisticky vyhodnocena metodou ANOVA. Protein CD46 jsme pomocí nepřímé imunofluorescenční mikroskopie lokalizovali na vnější akrozomální membráně býčí i kančí spermie. Na spermii po akrozomální reakci byl signál negativní. Dále byla přítomnost CD46 potvrzena imunodetekcí v proteinovém extraktu (47 kDa) z ejakulovaných a kapacitovaných spermiích, přičemž signifikantně vyšší množství proteinu jsme detekovali v kapacitovaných spermiích. Exprese genu pro protein CD46 v kančích reprodukčních orgánech byla pozitivní v testes, corpus a cauda epididymis, kdysignifikantně nejvyšší relativní expresi genu CD46 jsme pozorovali v testes. Protein CD52 jsme lokalizovali na celé hlavičce kančí spermie se silnějším signálem v akrozomu a v ekvatoriálním segmentu. Ve spermii býka jsme protein lokalizovali v oblasti akrozomu. V proteinovém extraktu z kančích ejakulovaných, kapacitovaných a akrozomálně zreagovaných spermiích jsme imunodetekovali čtyři izoformy s molekulovou hmotností 17, 19, 21, 24 kDa. Imunodetekce byla provedena i pro extrakty proteinů získaných metodou frakcionace membrán kančích spermiích. Detekovali jsme 19, 21 a 24kDa izoformu proteinu ve frakci plazmatické membrány, ale i ve frakci vnější a vnitřní akrozomální membrány, kde byl signál slabší. Imunodetekce proteinu CD52 v kančích reprodukčních orgánech byla pozitivní pouze pro cauda epididymis, kde jsme detekovali pět izoforem o molekulové hmotnosti 17, 19, 21, 24 a 26 kDa. Expresi genu CD52 jsme detekovali ve všech částech epididymis a testes kance, přičemž signifikantně nejvyšší relativní genová exprese byla nalezena v cauda epididymis. Z dosažených výsledků vyplývá, že protein CD46 je ve spermii kance i býka pravděpodobně lokalizován na vnější akrozomální membráně. Expresi tohoto proteinu jsme nedetekovali ve spermiích po akrozomální reakci. Naše výsledky studia proteinu CD52 naznačují, že tento protein by mohl být transferován na plazmatickou membránu kančí spermie během epididymální maturace. Nicméně pro detailnější analýzu fyziologické funkce vybraných CD molekul je třeba práci doplnit o další experimenty.

Abstract:

CD molecules are antigens in the cell membranes of the immune system. However, they have also been detected on tissues and cells of the reproductive tract, including gametes, where they may participate in events leading to their fusion. The thesis presented is focused on two CD molecules belonging to the family of complement regulating proteins - CD46 and CD52. The CD46 is thought to play a role in gamete fusion or it might play an important role in the stabilization of acrosome. The CD52 is also known as maturation-associated sperm antigen. The first aim of this diploma thesis was the localization of CD46 and CD52 proteins in boar and bull sperm and the detection of these proteins in the boar reproductive organs and the sperm of both species using immunofluorescence and immunodetection methods. Another aim was to observe the gene expression of these proteins in the testicular and epididymal tissue of the boar. The data were statistically evaluated by ANOVA. We localized the CD46 on the outer acrosomal membrane of bovine and boar sperm using indirect immunofluorescence microscopy. The signal was negative for sperm after the acrosomal reaction. Furthermore, the presence of CD46 was confirmed by immunodetection in a protein extract (47 kDa) from ejaculated and capacitated sperm with significantly higher amounts of protein in capacitated sperm. In boar reproductive organs expression of the CD46 gene was positive in testes, corpus, and cauda epididymis with significantly highest relative gene expression in testes. We localized the CD52 on the entire boar sperm head with a stronger signal in the acrosome region and the equatorial segment. In bull sperm, we localized the protein in the acrosome region. In a protein extract from ejaculated, capacitated, and acrosome-reacted sperm of boar, we immunodetected four isoforms with a molecular weight of 17, 19, 21, 24 kDa. Immunodetection was also performed for protein extracts obtained by isolation of sperm plasma and acrosomal membranes. We detected the 19, 21, and 24 kDa isoforms in the plasma membrane fraction and also in the outer and inner acrosomal membrane fractions, where the signal was weaker. Immunodetection of CD52 in boar reproductive organs was positive only for cauda epididymis, where we found five isoforms with molecular weights of 17, 19, 21, 24, and 26 kDa. CD52 gene expression was found in all segments of the boar epididymis and testes. Significantly highest relative gene expression was detected in the cauda epididymis. The results show that the CD46 protein is probably localized on the outer acrosomal membrane in boar sperm. We did not detect the expression of this protein in sperm after the acrosome reaction. Our results of the CD52 study suggest that this protein could be transferred to the plasma membrane of boar sperm during epididymal maturation. However, for a more detailed analysis of the physiological function of selected CD molecules, it is necessary to supplement the work with further experiments.

Kľúčové slová

CD46, CD52, akrozomální reakce, býk, epididymis, testes, genová exprese, kanec

Keywords

CD46, gene expression, acrosome reaction, CD52, epididymis, testes, boar, bull

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 4. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / odbor:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology