Molecular Modelling of Structure-Function Relationships in Enzymes

Mgr. David Bednář, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Disertační práce se zabývá studiem strukturních a funkčních závislostí v proteinech metodami molekulového modelování. V úvodních kapitolách je popsán teoretický zaklad stability proteinů. Stabilita je jednou z nejdůležitějších vlastností proteinů a odvíjí se od ní možnosti použití proteinů jak v základním výzkumu, tak i v průmyslu. Stabilitu dělíme na termodynamickou (rozdíl v energiích mezi sbaleným a rozvolněným stavem) a kinetickou (rozdělení stavů vysokou aktivační energií). Dále jsou diskutovány možnosti stabilizace proteinů od čistě experimentálních metod založených na řízené a saturační mutagenezi, přes identifikaci „hot-spotů“ až po sofistikované algoritmy kombinující výpočty volných energii a evoluční závislosti. Následující dvě kapitoly úvodu se zabývají metodami molekulového modelování a modelovými proteiny použitými ve výsledkové části. V této části je představena molekulová dynamika jako jedna ze základních metod s širokým uplatněním při popisu stability, aktivity, hydratace, enantioselektivity či substrátové specifity proteinů. Dalšími metodami jsou molekulový docking pro získávání vazebného modu a vazebné energie mezi substrátem a enzymem a hybridní kvantově mechanická a molekulově mechanická metoda pro popis reaktivity makromolekul. Výsledková část se skládá z pěti kapitol. První z nich (kapitola 4) popisuje výpočetní metodu FireProt pro efektivní stabilizaci proteinů. FireProt kombinuje evoluční přístup s výpočtem Gibbsovy volné energie doplněné o efektivní filtrování pomocí nejrůznějších in silico nástrojů. Metoda byla aplikována na enzymy halogenalkandehalogenasu DhaA a dehydrochlorinasu LinA s výsledným zvýšením termostability o 24 a 21°C. Kapitola 5 se věnuje stabilizaci lidského fibroblastového růstového faktoru FGF2. Tento protein se účastní četných regulačních procesů a dá se předpokládat dobré uplatnění stabilizované molekuly v medicíně i základním výzkumu. V současné době je hlavní a nejdůležitější aplikací přidávání FGF2 do média pro kultivaci kmenových buněk. Protein je však málo stabilní s poločasem rozpadu mezi 10 a 12 hodinami. Pomocí výpočtů volné energie programy Rosetta a FoldX a evolučního přístupu „back-to-consensus“ byly vytipovány stabilizující mutace. Ty byly skombinovány s mutacemi získanými saturační mutagenezí jednotlivých pozic. Výsledkem projektu byl protein se zvýšenou termostabilitou o 19 °C a se stabilitou v kultivačním médiu vice než dvacet dní. Další tři kapitoly se zabývají charakterizací různých vlastností enzymu DhaA. Kapitola 6 se věnuje vztahu mezi stabilitou a aktivitou. Stabilní čtyřbodový mutant DhaA vykazoval toleranci vůči organickým solventům, současně však měl velmi nízkou aktivitu. Pomocí jediné mutace v ústí přístupového tunelu došlo k výraznému zlepšení aktivity a přitom k zachování termostability a stability vůči organickým solventům. Tato jediná mutace zvýšila mobilitu sekundárních motivů ve svém okolí a výrazně zvětšila průměr tunelu. Kapitola 7 se zabývá metodou pro analýzu hydratace proteinů. Do ústí tunelu dvou dehalogenas byla vnesena flourescenční umělá aminokyselina, která vykazuje odlišný signál v přítomnosti různého počtu a chování molekul vody. Za pomoci molekulové dynamiky byla zjištěna různá hydratace obou dehalogenas, která úzce korelovala s experimentální flourescenční spektroskopiíTato nově vyvinutá technika značení a studia hydratace proteinů je široce aplikovatelná na různé proteiny. Poslední 8. kapitola se věnuje studiu enantioselektivity dehalogenas. Z předchozí studie vyplynulo, že enantioselektivita dehalogenasy DbjA s 2-brompentanem je způsobena zvýšenou hydratací v dobře přístupném aktivn

Abstract:

ím místě, která vede k vazbě substrátu podél hydrofobní stěny proteinu v konformaci výhodné pro (R)-enantiomer. Pětibodový mutant DhaA má opačné vlastnosti než DbjA (hůře přístupné a méně hydratované aktivní místo) a přesto vykazuje stejnou selektivitu. Kombinací přístupů místně-cílené mutageneze, kinetických měření a molekulového modelování byl vysvětlen rozdíl mezi dvěma různými způsoby enantiodiskriminace u dehalogenas.

Abstract:

This dissertation is devoted to studying the structure-function relationships of proteins using the methods of molecular modeling. In the opening chapter, the emphasis is on the theoretical basis of protein stability. Stability is one of the most important properties and the use of proteins depends on good stability in both basic research and industry. Stability can be divided into thermodynamic (the energy difference between folded and unfolded state) and kinetic stability (separation of relevant states by high activation energy). Several possibilities of protein stabilization are discussed ranging from purely experimental methods based on directed evolution and saturation mutagenesis, through identification of hot-spots, to sophisticated algorithms combining free energy calculations with the evolutionary inference. Next two chapters in introduction deal with the molecular modeling methods and model proteins used in the results section. Molecular dynamics is one of the most important methods that can be used to describe protein stability, activity, folding, hydration, enantioselectivity and substrate specificity. The other methods are molecular docking, which predicts binding modes and binding energy of the substrate-enzyme complex, and hybrid quantum mechanics and molecular mechanics methods used to describe the reactivity of macromolecules with small molecules. Results section consists of five parts. The first one (chapter 4), deals with the computational method FireProt applied for effective stabilization of a protein. FireProt combines evolutionary approach with a calculation of Gibbs free energy, complemented by efficient filtering using a variety of in silico tools. The method was applied to the enzyme haloalkane dehalogenase DhaA and dehydrochlorinase LinA resulting in thermostability increase 24 and 21 °C, respectively. Chapter 5 is focused on the stabilization of human fibroblast growth factor FGF2. This protein is involved in numerous regulatory processes, suggesting a good applicability in both medicine and basic research. Nowadays, the main application of FGF2 is its addition into the medium used for stem cells cultivation. However, FGF2 is not very stable with a half-life between 10 and 12 hours. Stabilizing mutations were identified by using the free energy calculation by Rosetta and FoldX in combination with evolutionary approach "back-to-consensus". These hits were combined with mutations from saturation mutagenesis libraries. The final nine-point mutant showed thermostability increase of 19 °C and was stable in the cultivation medium for more than twenty days. The chapters 6-8 deal with a characterization of DhaA enzyme. Chapter 6 focuses on the stability-activity relationships. A stable four-point mutant of DhaA showed tolerance against organic co-solvents, but on the other hand had a very low activity. A single mutation at the mouth of access tunnel significantly improved activity while preserving the thermostability and stability against organic co-solvents. A single mutation increased the mobility of secondary structures and significantly increased the diameter of the access tunnel. Chapter 7 deals with a method for the analysis of protein hydration. A fluorescent artificial amino acid, which provides a different signal in the presence of varying number of water molecules, was introduced into the tunnel mouth of two dehalogenases. Using molecular dynamics, different hydration of both dehalogenases was observed, which is in close correlation with experimental fluorescent spectroscopy. The last 8th chapter is devoted to the study of enantioselectivity of dehalogenases. Previous studies showed that the enantioselectivity of DbjA dehalogenase with 2-bromopentane is due to increased hydration in the accessible active site. Active site hydration aligned the substrate with the hydrophobic wall of the protein favoring the conformation of (R)-enantiomer. A five-point mutant of DhaA has the opposite properties of

Abstract:

its active site than DbjA (less hydrated and less accessible active site) and yet exhibits the same enantioselectivity. The difference in enantiodiscrimination of dehalogenases was explained using a combination of site-directed mutagenesis, kinetic measurements, and molecular modeling.

Keywords

molekulové modelování, enzym, proteinové inženýrství, stabilita, molecular modelling, enzyme, protein engineering, stability

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 2. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 21. 4. 2017
• Supervisor: prof. Mgr. Jiří Damborský, Dr.
• Reader: doc. RNDr. Robert Vácha, PhD., RNDr. Jiří Vondrášek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology