Subpopulace spermií v kryokonzervovaném ejakulátu dobře a špatně mrazitelných hřebců

Bc. Linda Nováčková

Diplomová práce

Subpopulation of spermatozoa in frozen-thawed ejaculate of good and poor freezers

Anotace:

Cílem této diplomové práce bylo zhodnotit výskyt subpopulací u vybraných hřebců a ověřit hypotézu, že zastoupení vybraných kategorií subpopulací spermií se liší mezi dobře a špatně mrazitelnými hřebci. Hodnocen byl ejakulát od 24 hřebců patnácti různých plemen, odebraný v Equinním reprodukčním centru ERC s. r. o. (Pardubice-Mnětice, ČR). Pomocí počítačem asistované analýzy spermií byla hodnocena motilita jednotlivých spermií ihned po rozmražení (T0) a po třiceti minutách inkubace (T30). Motilní spermie byla definována parametrem rychlost po průměrné dráze (VAP) > 15 μm/s. Na základě celkové motility (TMOT) byli hřebci rozdělení do kategorie dobře (DM) a špatně mrazitelní (ŠM). Dobře mrazitelní hřebci měli TMOT > 30 %. Dvoustupňová klastrová analýza byla použita k rozdělení motilních spermií do subpopulací. Hierarchická aglomerativní klastrová analýza ukázala, že je vhodné rozdělit zhodnocené spermie do 3, respektive 4 subpopulací. Nehierarchická k-průměry analýza přiřadila jednotlivé spermie do rapidní, rychlé, středně rychlé a pomalé subpopulace, pojmenované na základě parametru VAP. χ2 test zhodnotil výskyt jednotlivých subpopulací v každé kategorii mrazitelnosti a času inkubace. Analýza variance zhodnotila rozdílnost subpopulací mezi ŠM a DM hřebci v čase inkubace T0 a T30.Byl zjištěn statisticky významný rozdíl u většiny parametrů motility mezi subpopulacemi spermií dobře a špatně mrazitelných hřebců a také byl zjištěn signifikantní vliv času inkubace na kinematické parametry spermií ve sledovaných subpopulacích. Procentuální zastoupení rychlé a rapidní subpopulace je vyšší u DM hřebců. Spermie DM hřebců jsou přímější. Spermie spadající do rapidní subpopulace DM hřebců jsou rychlejší než spermie ŠM hřebců, spermie rychlé subpopulace jsou rychlejší u ŠM hřebců, spermie ve středně rychlé subpopulaci jsou rychlejší u DM hřebců a spermie z pomalé subpopulace dosahují vyšší průměrné rychlosti u ŠM hřebců než u DM hřebců. Spermie ŠM hřebců jsou citlivější na prodlouženou dobu inkubace než spermie DM hřebců. Spermie, které přežily kryokonzervační proces, mají dobrou motilitu a je pravděpodobné, že limitním faktorem pro kvalitu spermií ŠM hřebců je spíše kvalita plazmatické membrány. V případě nutnosti kryokonzervace a následného využití spermatu od ŠM hřebců je doporučen rozdílný přístup zpracování ejakulátu a použití jiného typu inseminace.

Abstract:

The aim of this study was to evaluate the presence of subpopulation in chosen stallions and to verify the hypothesis, that subpopulations are differently represented in good and poor freezers.Twenty-four stallions representing 15 breeds have been used for this study. Their ejaculates have been gained in the Equine reproduction centre ERC Ltd. in Pardubice-Mnětice, CZ. The motility of individual sperms has been evaluated using Computer assisted sperm analysis immediately after thawing (T0) and after 30 minutes of incubation (T30). The spermatozoa have been assumed motile when the parameter velocity in an average pathway (VAP) > 15 μm/s. Stallions have been divided based on a total motility (TMOT) into categories of good (DM) and poor (ŠM) freezers. The limit for good freezers has been TMOT > 30 %. Two steps cluster analysis has been used to divide motile spermatozoa into subpopulations. Hierarchical agglomerative cluster analysis has designed a division into 3 respectively 4 clusters. Non-hierarchical k-means cluster analysis categorized individual spermatozoa into subpopulation rapid, fast, medium and slow. The subpopulations were named after VAP parameter. χ2 test evaluated the occurrence of each subpopulation in each category of freezability and time of incubation. Variance analysis evaluated differences of subpopulations in categories of poor and good freezers in the time of incubation T0, T30.Statistically significant differences were found in most motility parameters between poor and good freezers and between time of incubation T0 and T30, p < 0,05. There has been more percent of rapid and fast subpopulation in good freezers then in poor freezers. Spermatozoa of good freezers are more linear. The rapid subpopulation of good freezers is faster, the fast subpopulation of poor freezers is faster, the medium subpopulation of good freezers is faster and finally the slow subpopulation of poor freezers has higher average values of velocity parameters then spermatozoa of good freezers. Spermatozoa of poor freezers are more sensitive to extended time of incubation. Sperm cells, which have survived the cryopreservation, have had good velocity and it is assumed that the limiting factor of poor freezers´ sperms´ qualities is a quality of plasmatic membrane.A different approach of processing and usage of the insemination dose of the stallions with different freezability is recommended.

Klíčová slova

spermie, klastrová analýza, CASA, hřebec, reprodukce

Keywords

reproduction, spermatozoa, cluster analysis, CASA, stallion

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 4. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Ing. Jiří Šichtař, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Genové technologie a šlechtění / Reprodukční biotechnologie