Příprava konstruktů pro bimolekulární fluorescenční komplementaci za účelem studia interakce PRKK a MAPK vojtěšky seté

Klára GRYGAROVÁ

Bakalářská práce

Preparation of bimolecular fluorescence complementation constructs to study the interaction of alfalfa PRKK and MAPKs.

Anotace:

Vojtěška setá (Medicago sativa L.) patří mezi nejvýznamnější zemědělsky využitelné plodiny. Při působení biotického nebo abiotického stresu a vývojových podnětů dochází k aktivaci mitogenem aktivovaných proteinových kinas (MAPK), které přenáší signál v buňce pomocí fosforylace. Díky signalizaci MAPK kaskád dochází k regulaci růstu, vývojových procesů rostlin a odpovědí na stresové podmínky. V práci byla studována interakce PATOGEN RESPONZIVNÍ MAP KINASY KINASY (PRKK) se STRESEM INDUKOVANOU MAP KINASOU (SIMK) a STRESEM AKTIVOVANOU MAP KINASOU (SAMK) pomocí 2-in-1 bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC). Konstrukty byly připraveny klonovací metodou MultiSite Gateway. Expresní plasmidy byly vytvořeny pro transientní transformaci Nicotiana benthamiana pomocí Agrobacterium tumefaciens. Funkčnost konstruktů pBiFCt-2in1-CC PRKK-cYFP/SIMK-nYFP a pBiFCt-2in1-CC PRKK cYFP/SAMK nYFP byla ověřena konfokální laserovou skenovací mikroskopií. Při interakci PRKK-cYFP se SIMK-nYFP i SAMK-nYFP byl detekován signál žluté fluorescence v jádře a cytoplasmě. Interakce PRKK se SIMK a SAMK tak byla potvrzena pomocí in vivo metody 2-in-1 BiFC. Práce byla navíc doplněna o in silico analýzy predikcí těchto protein-proteinových interakcí, které podpořily experimentální výsledky.

Abstract:

Alfalfa (Medicago sativa L.) is one of the most important agricultural crops. Upon exposure to biotic or abiotic stress and developmental stimuli, mitogen-activated protein kinases (MAPKs) become activated and transmit signals within the cell through phosphorylation. MAPK signaling cascades regulate plant growth, developmental processes, and responses to stress conditions. This study investigated the interaction of the PATHOGEN-RESPONSIVE MAP KINASE KINASE (PRKK) with STRESS-INDUCED MAP KINASE (SIMK) and STRESS-ACTIVATED MAP KINASE (SAMK) using the 2-in-1 bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Constructs were prepared using the MultiSite Gateway cloning method. The expression plasmids were created for the transient transformation of Nicotiana benthamiana using Agrobacterium tumefaciens. The functionality of the pBiFCt 2in1 CC PRKK-cYFP/SIMK-nYFP and pBiFCt-2in1-CC PRKK cYFP/SAMK-nYFP constructs was verified by confocal laser scanning microscopy. During the interaction of PRKK-cYFP with both SIMK-nYFP and SAMK-nYFP, a yellow fluorescence signal was detected in the nucleus and cytoplasm. The interaction of PRKK with SIMK and SAMK was thus confirmed in vivo using the 2-in-1 BiFC. The study was further supplemented by in silico analyses predicting these protein-protein interactions, which supported the experimental results.

Klíčová slova

PRKK, SIMK, SAMK, mitogenem aktivované proteinové kinasy, vojtěška setá

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 4. 5. 2026

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 3. 6. 2026
• Vedoucí: Mgr. Jiří Sojka, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biotechnologie a genové inženýrství / Biotechnologie a genové inženýrství