Cílení na signální dráhy řídící růst melanomu

Mgr. Veronika Palušová, Ph.D.

Doctoral thesis

Targeting signaling pathways regulating the growth of melanoma

Abstract:

ÚVOD: Melanomy patří do skupiny maligních nádorů s vysokým stupněm mutagenicity, která negativně ovlivňuje jejich odpověď na protinádorovou léčbu. Růst melanomů je obvykle poháněn mutacemi onkogenů BRAF nebo NRAS, které konstitutivně aktivují MEK-ERK signalizaci. Zatímco účinná léčba cílící na mutovaný protein RAS není dostupná, několik inhibitorů kinázy BRAF je s úspěchem požíváno při léčbě melanomů s mutací BRAF. Obvykle se však během několika měsíců na tato léčiva vyvine rezistence. Dalším potenciálním terapeutickým cílem v buňkách melanomu je dráha mTOR, která koordinuje růst buňky v závislosti na dostupnosti nutričních zdrojů a extracelulárních růstových faktorů. Současné cílení na více signálních drah podporujících proliferaci buněk za použití duálně působících léčiv nebo kombinací inhibitorů by mohlo představovat účinnější strategii pro boj s nádorem a pro prevenci vzniku rezistence k léčivu. Tato práce si klade za cíl prozkoumat molekulární mechanismy podílející se na odpovědi melanomových buněk na působení vybraných tříd chemických sloučenin a jejich kombinací a studovat mechanismy, které stojí za mimořádnou schopností melanomů překonat nepříznivé podmínky vyvolané léčbou. METODY: K řešení výzkumných problémů bylo použito následujících metod: Techniky molekulární biologie a biochemie: elektroforéza v polyakrylamidovém gelu, imunoblotování, imunoprecipitace, luciferázový reportérový test, kinázové testy in vitro; elektronová a fluorescenční mikroskopie, mikroskopie živých buňek, kvantifikace intracelulárních metabolitů pomocí NMR spektroskopie, izolace RNA a analýza genové exprese pomocí qRT-PCR. Techniky buněčné biologie: kultivace savčích a bakteriálních buněk, přechodná a stabilní transfekce, analýza buněčného cyklu a proliferace, testování účinku nízkomolekulárních látek na savčí buňky, průtoková cytometrie. VÝSLEDKY: Identifikovali jsme mechanismus působení pyridinylimidazolových sloučenin běžně používaných jako inhibitory p38 MAPK na růst buněk maligního melanomu nesoucích mutaci BRAF V600E. Látky přímo inhibují mutovanou kinázu BRAF a potlačují aktivaci jejích cílů MEK a ERK. Kromě účinku na dráhu ERK narušují pyridinyl imidazoly endocytózu, což vede k akumulaci velkých endocytických veziklů, k delokalizaci mTOR a k deaktivaci signalizace mTORC1. Popsali jsme tedy mechanismy nezávislé na p38, kterými pyridinylimidazolové sloučeniny deregulují dvě základní prorůstové signální dráhy, zastavují buněčný cyklus a snižují životaschopnost buněk melanomu při nedostatku živin, narušení funkce endoplazmatického retikula nebo v reakci na inhibici kinázy PI3K. ZÁVĚR: Tato studie odhalila duální inhibiční účinek pyridinylimidazolových sloučenin na dvě kritické signální dráhy podporující proliferaci buněk nesoucích mutaci BRAF. Tyto sloučeniny indukují citlivost buněk vůči dalším stresovým faktorům a omezují adaptabilitu buněk melanomu. Naše poznatky poskytují informace, které by mohly napomoci vývoji nových léčiv založených na pyridinylimidazololovém základu.

Abstract:

INTRODUCTION: Melanomas belong to a group of malignant tumors with a high mutagenic rate, negatively affecting their response to drug treatment. Melanoma growth is commonly driven by acquired mutations in BRAF and NRAS oncogenes, which constitutively activate the MEK-ERK signaling. Whereas effective anti-RAS therapy remains elusive, several BRAF inhibitors are clinically used to eliminate BRAF-mutated melanomas. However, in many cases, drug resistance appears after a few months. Another potential therapeutic target in melanoma is the mTOR signaling pathway, which coordinates cell growth in response to nutrient availability and extracellular growth factors. Simultaneous targeting of different signaling pathways regulating cell growth with dual-acting drugs or combinations of small molecule inhibitors could more effectively combat cancer and prevent drug resistance development. This thesis aims to investigate molecular mechanisms participating in the response of melanoma cells to selected classes of chemical compounds and their combinations and study the mechanisms which stand behind the extraordinary capability of melanomas to overcome unfavorable conditions induced by drug treatments. METHODS: A panel of methods has been employed to address diverse scientific problems: Molecular biology techniques & biochemistry: polyacrylamide gel electrophoresis, immunoblotting, immunoprecipitation, luciferase reporter assay, in vitro kinase assay, electron and fluorescence microscopy, live-cell imaging, quantification of intracellular metabolites using NMR spectroscopy, RNA isolation, and gene expression analysis by qRT-PCR. Cell biology techniques: Mammalian and bacterial cell culture, transient and stable transfection, analyses of cell cycle progression and proliferation, small molecule drug testing, and flow cytometry. RESULTS: We identified an effect of pyridinyl imidazole compounds commonly used as p38 MAPK inhibitors on the growth of malignant melanoma cells bearing the BRAF V600E mutation. The substances directly inhibit the mutated BRAF kinase and dirupt the activation of its downstream targets MEK and ERK. Apart from the effect on ERK, pyridinyl imidazoles disrupt endocytosis, which results in the accumulation of large endocytic vesicles, leading to the mTOR delocalization and deactivation of mTORC1 signaling. Thus, we described p38-independent mechanisms by which pyridinyl imidazole compounds deregulate two essential pro-growth signaling pathways, arrest cell cycle progression, and decrease melanoma cells’ viability under nutrient starvation, ER stress, or in response to PI3K inhibition. CONCLUSIONS: This study revealed a dual inhibitory effect of pyridinyl imidazole compounds on two critical pro-proliferative signaling pathways in BRAF-mutated cells. The compounds induce cell susceptibility to additional stressors and limit the adaptability of melanoma cells. Our findings provide a rationale for developing novel anti-melanoma small-molecule drug therapies based on the pyridinyl imidazole core.

Keywords

Melanom, rezistence vůči lékům, pyridinyl imidazoly, ERK, BRAF V600E, endozom, lysozom, membránové lipidy, mTORC1, narušení funkce endoplazmatického retikula Melanoma, drug resistance, pyridinyl imidazole, endosome, lysosome, membrane lipids, disruption of endoplasmic reticulum

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 9. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 5. 11. 2020
• Supervisor: Mgr. Stjepan Uldrijan, CSc.
• Reader: Mgr. Vladimír Čermák, Ph.D., doc. Mgr. Roman Hrstka, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Biomedical sciences / Biochemistry and Molecular Biology