Použití CRIPR/Cas9 a nové techniky značení zárodečných buněk pro náhradní reprodukci u jeseterů

MSc. Abdul Rasheed KHANZAI BALOCH

Doctoral thesis

Utilization of CRISPR/Cas9 and novel germ cells labelling technique for surrogate production in sturgeons

Abstract:

Sturgeons are commonly known as living fossils or ancient giants that diverged from ancient pre-Jurassic teleost lineage approximately ~300 million years ago (Mya). Sturgeons' 85% species are listed as critically endangered in the International Union for Conservation of Nature (IUCN). Sturgeons' reproductive traits such as delay in sexual maturation and periodic interrupted spawning cycles make their rehabilitation more difficult. However, among sturgeon species, the sterlet (Acipenser ruthenus) has shortest sexual maturation period. Therefore, it can be used as a host in surrogate production in sturgeons. Dnd1 was discovered as germ-plasm specific maternal RNA that exclusively expresses in vertebrate germ-line. Various studies have confirmed that dnd1 protein is essential for Primordial Germ Cells (PGCs) migration; and disruption of the PGCs migration affects fish fertility. Dnd1 deficient PGCs in zebrafish transdifferentiate into somatic cells. Previously our colleagues used morpholino oligonucleotide to knock down dnd1 in sterlet to produce germ cell free host for surrogate production. CRISPR/Cas9, a cutting-edge genome editing technology is being used in different research fields; here we thus aimed to harness the power of aforementioned technology to knock out dnd1 in sterlet. No or less number of PGCs were observed in CRISPR/Cas9 injected embryos as compared to control group injected with FITC-dextran only in order to label PGCs. Furthermore, we compared three different sterilization techniques viz., CRISPR/Cas9 and morpholino oligonucleotide (MO) targeting dnd1 and ultraviolet irradiation to eliminate PGCs in sterlet. Our data showed higher hatching and survival rates in CRISPR/Cas9, UV irradiation, and MO knockdown groups, respectively. Interestingly, some embryos treated with CRISPR/Cas9 displayed malformations. We presume that malformations were due to off-target effects and/or due to double injections i.e., injection of CRISPR/Cas9 at animal pole to knock-out the dnd1 and FITC-dextran at vegetal pole. Taking advantages of Iron Oxide nanoparticles (IONs) applications in various burgeoning research fields, we opted to use them to label PGCs in sturgeons. We injected IONs combined with FITC-dextran into vegetal pole of sturgeon embryos, and have successfully labelled the PGCs. Injection of IONs in sturgeons did not affect hatching and survival rates of embryos. Interestingly at 5 dpf, significantly less number of FITC-dextran labelled PGCs in FITC-dextran/IONs injected group were observed when compared with PGCs that were labelled with FITC-dextran only. Less number of PGCs in IONs injected group presumably could be because of interference posed by IONs to PGCs during the course of their migration. This is first study of its kind where germ cells of any species have been labelled by using nanoparticles. In conclusions, this thesis provides information regarding role of Dnd1 protein as potential germ-cell molecular marker in various fish species, and its use for conservation of fish species. Dnd1 knockout sterlet can be potentially used as sterile host for surrogate production in sturgeons. Moreover, labelling of PGCs in sturgeons by using IONs can thus open new avenues to study interactions of nanoparticles with cells that will ultimately help in hyperthermia where cells/tissues are exposed to electromagnetic field increasing temperatures to activate their death. After insertion of IONs to PGC in sturgeon embryo, it could be possible to isolate PGC using a magnetic field or to apply hyperthermia for host sterilization purpose.

Abstract:

Jeseteři, obvykle také známí jako žijící fosilie, nebo starověcí giganti, se odštěpili od starověké pre-Jurské line kostnatých ryb přibližně před 300 miliony let. Osmdesát pět procent druhů jeseterů je podle Mezinárodního svazu ochrany přírody (IUCN) řazeno mezi kriticky ohrožené. Charakteristiky reprodukce jeseterů, jako například pozdní pohlavní dospělost a periodicky přerušovaný reprodukční cyklus komplikuje jejich obnovu. Jeseter malý (Acipenser ruthenus) patří k jeseterům s nejkratší dobou dospívání. Proto by mohl být použit jako recipient pro náhradní reprodukci jeseterů. Dead end gen (dnd1) byl objeven jako maternální RNA se specifickou expresí výhradně v zárodečné linii obratlovců. Různé studie potvrdily, že protein Dnd1 je nezbytný pro migraci primordiálních gonocytů (PGC) a že narušení migrace PGC ovlivňuje plodnost ryb. PGC u zebřičky pruhované deficientní na Dnd1 protein se transdiferencují do somatických buněk. Naši kolegové v minulosti využili antisense morfolino oligonukleotid (MO) způsobující knock-down dnd1 u jesetera malého, aby produkovali recipienty bez zárodečných buněk pro techniku náhradní reprodukce. CRISPR / Cas9, technologie pro úpravu genomu, se používá v různých oblastech výzkumu; zde jsme se proto snažili využít možnosti výše zmíněné technologie ke knock-outu dnd1 u jesetera malého. U embryí injikovaných CRISPR/Cas9 byl pozorován nulový, nebo menší počet PGC ve srovnání s kontrolní skupinou injikovanou pouze fluorescein isothiocyanatem konjugovaným s dextranem (za účelem značení PGC). Dále jsme srovnávali tři různé techniky: CRISPR/Cas9, UV záření a MO. Naše údaje ukázaly vyšší míru vykulení a přežití ve skupinách CRISPR/Cas9, následovalo UV a jako poslední MO. Je zajímavé, že některá embrya ošetřená CRISPR/Cas9 vykazovala malformace, předpokládáme tedy, že malformace byly způsobeny účinky off-targetu a/nebo v důsledku dvojitých injikací, tj. injikací CRISPR/Cas9 do animálního pólu a FITC-dextran do vegetativního pólu. Vzhledem k výhodám aplikace nanočástic v různých rozvíjejících se výzkumných oborech jsme se rozhodli je použít ke značení PGC u jeseterů. Injikovali jsme nanočástice oxidu železa v kombinaci s FITC-dextranem do vegetativního pólu embryí a úspěšně jsme takto PGC označili. Injikace nanočástic do jeseterů neovlivnila míru vylíhnutí a přežití embryí. Je zajímavé, že 5 dní po oplození bylo ve skupině injikovaných s FITC-dextranem a nanočásticemi pozorováno signifikantně nižší množství značených PGC ve srovnání s PGC, které byly označeny pouze FITC-dextranem. Jedná se o první studii svého druhu, ve které byly zárodečné buňky označeny nanočásticemi. Tato práce poskytuje informace o úloze proteinu Dnd1 jako potenciálního molekulárního markeru zárodečných buněk u různých druhů ryb a jeho využití pro ochranu ohrožených i kriticky ohrožených druhů ryb. Dnd1 knock-out u jesetera malého může být potenciálně použit jako metoda pro vytvoření sterilního hostitele pro náhradní reprodukci jeseterů. Navíc značení PGC u jeseterů pomocí nanočástic může otevřít nové cesty ke studiu interakce nanočástic s buňkami, které mohou v kombinaci s hypertermií, při které jsou buňky nebo tkáně vystaveny elektromagnetickému poli způsobujícímu lokální zvýšení teploty, aktivovat buněčnou smrt. Po vložení nanočástic do PGC embrya jesetera by mohlo být možné izolovat PGC pomocí magnetu nebo aplikovat hypertermii pro účely sterilizace recipientů.

Keywords

jeseteři, CRISPR/Cas9, Dnd1, sterilizace, náhradní rodičovství, nanočástice

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 2. 9. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: doc. Ing. Martin Pšenička, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / odbor:
Zootechnics / Fishery