Vztah mezi primární strukturou a konformací DNA biologicky důležitých oblastí lidského genomu

Mgr. Daniel Renčiuk, Ph.D.

Doctoral thesis

Relationship between DNA primary structure and conformation of biologically important regions of the human genome.

Anotácia:

Lidská DNA vytváří kromě klasické dvoušroubovice řadu neobvyklých sekundárních struktur: Z-DNA, vlásenky, cytosinové a guaninové kvadruplexy. Tyto struktury jsou často součástí regulačních oblastí genů, v řadě případů je jejich přítomnost spojena s výskytem nějakého onemocnění. Pomocí CD spektroskopie, UV absorpční spektroskopie, polyakrylamidové gelové elektroforézy a využitím chemických a enzymatických sond jsem studoval konformační vlastnosti oligonukleotidů odvozených od významných úseků lidské DNA: G-bohatého řetězce telomerní DNA, sekvence NHE-III1 genu c-myc, a tandemového opakování (CGG)n v 5` UTR genu fmr1. Znalost struktury těchto oblastí je základním předpokladem účinné terapie chorob s nimi spojených. Lidská telomerní sekvence tvoří ve vodném prostředí s K+ ionty antiparalelní guaninový kvadruplex. Ukázal jsem, že v prostředí vysoké molekulové hustoty simulované etanolem přechází do zvláštního, (3+1) hybridního kvadruplexu a následně do kvadruplexu paralelního. S rostoucí délkou sekvence je přechod snazší. G-bohatý řetězec sekvence NHE-III1 genu c-myc tvoří ve vodném prostředí s K+ ionty velmi stabilní paralelní guaninový kvadruplex. Nalezl jsem nejpravděpodobnější místo vzniku kvadruplexu: 5` terminální část NHE-III1 se čtyřmi těsně následujícími G-bloky, které umožňují vznik kvadruplexu se třemi tetrádami a nejkratšími možnými smyčkami. Tandemové opakování (CGG)n je spojeno se syndromem fragilního X chromozomu (FRAXA). U zdravých jedinců je tato sekvence přerušena triplety AGG. Ukázal jsem, že na rozdíl od publikovaných dat sekvence (CGG)n netvoří ve vodném roztoku kvadruplexy. Kvadruplexy vznikají pouze v zahuštěném prostředí. Avšak nemohou být příčinou prodlužování motivu, neboť triplety AGG tvorbu kvadruplexů podporují. (CGG)n sekvence tvoří i Z-formu a to nezávisle na délce i na přítomnosti AGG tripletů. Z-DNA se tedy neúčastí mechanismů vzniku FRAXA. Nepřerušené sekvence (CGG)n se obtížně ohýbají. Nedefinované místo ohybu způsobuje prokluzování řetězce duplexu umožňující opakovanou replikaci a tedy expanzi sekvence. Triplety AGG způsobují vznik přesně definovaných vlásenek, přičemž tvoří jejich smyčku. Tímto způsobem brání triplety AGG expanzi motivu.

Abstract:

Besides classic double-helix, human DNA forms number of unusual secondary structures: Z-DNA, hairpins, cytosine and guanine quadruplexes. These structures are usually part of a gene regulatory sequences, in many cases their presence corresponds to several diseases. Using CD spectroscopy, UV absorption spectroscopy, polyacrylamide gel electrophoresis and chemical and enzymatic probes I studied conformational properties of oligonucleotides derived from imporant regions of human DNA: G-rich strand of telomeric DNA, NHE-III1 sequence from c-myc gene and a (CGG)n tandem repeat in the 5`-UTR of a fmr1 gene. Understanding the structure of these regions is fundamental for effective therapy of diseases linked to them. Human telomeric sequence forms antiparallel guanine quadruplex in a K+ containing aqueous solution. I showed the transition to a special, hybrid (3+1) and to a parallel quadruplex in crowded solution, simulated by ethanol. Increasing length of the sequence facilitates the transition. G-rich strand of the NHE-III1 sequence forms very stable parallel quadruplex in a K+ containing aqueous solution. I found the most probable site of quadruplex formation: the 5` part of NHE-III1 containing four tightly following G-blocks, which facilitate the formation of three-tetrad quadruplex with the shortest possible loops. (CGG)n tandem repeat is associated to a fragile-X syndrome (FRAXA). Healthy individuals have this sequence interrupted by AGG triplets. I showed, contrary to literature, that (CGG)n does not form guanine quadruplex in K+ containing aqueous solution. Quadruplexes are formed in crowded solutions. However, they can not be the reason of motif expansion, because the AGG triplets support their formation. (CGG)n forms also Z-DNA and the formation was independent of sequence length and presence of AGG triplets. Thus, Z-DNA does not influence the mechanisms of FRAXA. Uninterrupted (CGG)n sequences are reluctant to bend. Undefined, random bending site causes sliding of duplex, which leads to a repeated replication and, thus, to a expansion of the sequence. AGG triplets cause formation of precisely defined hairpins where they form loops. This way AGG triplets prevent motif expansion.

Kľúčové slová

CD spektroskopie, telomera, FRAXA, c-myc, konformace DNA, CD spectroscopy, telomere, DNA conformation

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 10. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 6. 11. 2009
• Vedúci: prof. RNDr. Michaela Vorlíčková, DrSc.
• Oponent: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc., doc. RNDr. Jana Kašpárková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology