Vizualizace biofilmu a možnosti využití této techniky pro jeho průkaz a sledování interakcí mezi klinicky významnými mikroorganizmy

Bc. Gabriela Stejskalová

Master's thesis

Biofilms visualization and possibilities of this technique for monitoring the card and interactions between organisms clinically significant

Anotácia:

Předložená diplomová práce byla zaměřena na vizualizaci tvorby mikrobiálního biofilmu s hodnocením vztahů mezi jednotlivými testovanými kmeny mikroorganizmů a na možnosti biologického ovlivnění produkce biofilmu. Do testů bylo zařazeno 305 kmenů bakterií a 104 kmenů kvasinek. Pomocí Christensenovy metody byla produkce biofilmu u bakterií prokázána u 101 kmenů (33,1%), kdy z tohoto množství bylo 12 kmenů (11,9%) označeno jako hyperproducenti. U kvasinek bylo biofilm pozitivních kmenů 24 (23,1%), z toho hyperprodukující 3 (12,5%) kmeny. Vybrané kmeny byly pro vizualizaci biofilmu testovány v různých modifikacích technikou růstu na úzkém podložním mikroskopickém skle, které bylo ponořeno do suspenze kultury v Sabouraudově tekutém médiu s 8% glukózy v plastové zkumavce. Ukončení testu bylo prováděno sušením a fixací preparátu metylalkoholem a následným barvením dle Grama. Diferenciace preparátů byla prováděna světelným mikroskopem při zvětšení 630 ? 1000x. Vztahy mezi jednotlivými mikroorganizmy byly testovány popsanou sklíčkovou technikou a také pomocí Christensenovy metody v mikrotitračních destičkách za použití stejného kultivačního média. Biofilm pozitivní kmeny vytvářely na mikroskopickém skle mnohobuněčná hnízda ? mikrokolonie spojené mezi sebou úzkými můstky do podoby nepravidelné sítě, kterou jsme v našem testu hodnotili jako zcela běžnou formu produkce biofilmu. Při hodnocení směsných kultur mikroorganizmů jsme pozorovali koagregaci použitých kmenů pouze v systému kvasinka + některá Gram negativní tyčinka. Žádný zjevný posun ve vizualizaci nepřineslo ani prodloužení inkubační doby až na 120 hodin. Pro sledování biologického ovlivnění produkce a charakteru biofilmu bylo použito biopreparátu obsahujícího živou kulturu mikromycety Pythium oligandrum. Tyto testy probíhaly také jako sklíčkové kultury a jako testy v mikrotitrační destičce. Mikroskopická vizualizace přinesla informace pouze o snížené aktivitě tvorby biofilmu v systému s P. oligandrum, nebylo ji však možné blíže kvantifikovat. Při použití mikrotitračních destiček byly získané výsledky více průkaznější. Bylo zjištěno, že s rostoucí délkou expozice biofilmu, či biofilm pozitivního mikroorganizmu s P. oligandrum stoupá procento významného poklesu produkce biofilmu. Je tedy možné předpokládat, že použití P. oligandrum může významně ovlivnit virulenci některých mikroorganizmů. Tento fenomén zjištěný in vitro však bude pro medicínské využití vyžadovat další testy a ověření. Zklamáním pro nás bylo zjištění, že technika barvení dle Grama je vhodná pouze pro základní vizualizaci ? průkaz tvorby biofilmu, ale není příliš vhodná pro studium struktury biofilmu a vztahů mezi přítomnými mikroorganizmy.

Abstract:

This thesis focused on the visualization of microbial biofilm formation with the assessment of relations between the tested strains of microorganisms and the possibility of a biological effect on the production of biofilm. The test included 305 strains of bacteria and 104 strains of yeast. With Christensen method, the production of biofilm in bacteria detected in 101 strains (33.1%), when this amount was 12 strains (11.9%) identified as hyperproducenti. The yeasts were biofilm positive strains 24 (23.1%), of which hyperprodukující 3 (12.5%) strains. Selected strains were tested for the visualization of the biofilm in various modifications technique growth narrow a glass microscopic glass, which has been immersed in a suspension culture in Sabouraud liquid medium with 4% glucose in a plastic tube. End test was carried out by drying and fixation agent methylated spirits and then stained by Gram stain. Differentiation of specimens was performed by light microscope at a magnification of 630 - 1000. Relationships between different microorganisms were tested by slide technique described by Christensen and methods in microtiter plates using the same medium. Biofilm positive strains to produce microscopic glass multicellular nests - microcolonies connected to each other by narrow bridges to form an irregular network, which we have in our test was considered quite a common form of biofilm production. When evaluating mixed cultures of microorganisms were observed koagregaci used only in strains of yeast + some Gram negative rod. No apparent shift in the visualization did not bring an extension incubation time up to 120 hours. To monitor the biological effect on the production and nature of the biofilm was used bio-preparation containing live culture micromycetes Pythium oligandrum. These tests were carried out as by slide culture and such tests in a microtiter plate. Microscopic visualization provided information only on the reduced activity of biofilm in the system with P. oligandrum, but it was not possible to further quantify. When using a microplate, the results were more conclusive. It was found that with increasing duration of exposure of biofilm or biofilm positive microorganism with P. oligandrum increasing percentage of a significant decrease in the production of biofilm. It can therefore be assumed that the use of P. oligandrum may significantly affect the virulence of some microorganisms. This phenomenon observed in vitro, however, will be for medical use require further testing and validation. Disappointment for us was that the Gram stain technique is only suitable for basic visualization - evidence of biofilm, but not very suitable for the study of biofilm structure and relationships between microorganisms present.

Kľúčové slová

Biofilm, Produkce, Vizualizace, Ovlivnění, Pythium oligandrum

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 5. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 4. 6. 2014
• Vedúci: MUDr. Karel Mencl

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Master programme / odbor:
Special Chemical and Biological Programmes / Analysis of Biological Materials