Komplexy oxidu osmičelého jako elektroaktivní značky pro DNA a jejich analytické využití

Mgr. Pavel Kostečka, Ph.D.

Disertační práce

Osmium tetroxide complexes as electroactive markers for DNA and their analytical utilization

Anotace:

Konvenční přístupy analýzy sekvencí DNA a RNA se obvykle opírají o nepřímé metody, jejichž výsledkem je získání otisku DNA (DNA fingerprint) většinou v podobě spektra restrikčních fragmentů. Současné metody jsou často založeny na odlišeném chování heteroduplexu (vzniklého spárováním standardního a mutantního řetězce) a homoduplexu (vzniklého spojením plně komplementárních úseků) – detekuje se změna elektroforetické mobility, změna citlivosti ke štěpení nukleázami aj. Tyto techniky – ač poskytují přesné výsledky – jsou relativně nákladné, pracné a časově náročné. Z tohoto důvodu je věnována značná pozornost vývoji levných, snadno ovladatelných biosenzorů, mimo jiné elektrochemických. Tato práce byla zaměřena na použití elektrochemických technik pro detekci hybridizace DNA a vyhledávání bodových mutací. Více než měření vlastních elektrochemických signálů DNA se v poslední době z řady důvodů využívá značení DNA elektroaktivními značkami. V naší laboratoři máme více jak 20tiletou zkušenost s komplexy oxidu osmičelého (Os,L), které se kovalentně vážou na nespárované pyrimidinové (především thyminové) zbytky v DNA. DNA značená těmito komplexy poskytuje sérii faradaických signálu na rtuťových a uhlíkových elektrodách, na rtuťových elektrodách pak rovněž vysoce citlivý katalytický signál. Zjistili jsme, že katalytický signál je možné získat i na rtuťových filmových elektrodách MFE a využít tato měření pro bioanalytické účely. (Použití MFE může v některých případech být z praktických důvodů vhodnější než HMDE.) Při analýze jsme využili tzv. dvoupovrchovou metodu, kdy hybridizace DNA a její detekce probíhá na samostatném povrchu (paramagnetických částicích resp. elektrodovém povrchu), a bylo tak možné optimalizovat jednotlivé kroky nezávisle. Mimo MFE jsme metody s úspěchem využili pro detekci hybridizace na uhlíkových elektrodách. Dále jsme testovali možnost záměny ligandu v Os,L namísto zavedeného bipy. Zjistili jsme, že Os,L poskytují signály při různých potenciálech v závislosti na zvoleném L – rozdíl potenciálů by dostatečně velký, takže bylo možné hybridizovat DNA s několika cílovými sekvencemi se signálními sondami značenými různými Os,L zároveň. Předběžně jsme testovali možnost elektrochemické detekce změn v nukleotidové sekvenci (mutací) zahrnujících změny v počtu thyminových zbytků reagujících s Os,bipy. Podařilo se nám elektrochemicky od sebe odlišit ssDNA i heteroduplexy lišící se v počtu thyminů o jediný oligonukleotid.

Abstract:

Conventional approaches of analysis of DNA and RNA sequences are usually based on indirect methods whose results are DNA fingerpints represented by restriction fragment spectra. Current methods often utilize different behavior of heteroduplex (formed by pairing of mutant and standard (wild-type) strands) and homoduplex (formed by pairing fully complementary strands) reflected in changes in electrophoresis mobility, susceptibility to cleavage by nucleases etc. Although these techniques can provide accurate results, they are rather expensive, laborious and time-consuming. For this reasons great atteition is paid to developing of cheap, easy-to-use biosensors, besides them electrochemical. This work is concentred on use of electrochemical techniques for detection of DNA hybridisation and searching for mutations. Rather than measurement of intrinsic DNA signals, labeling of DNA by electroactive tags has been preffered up-to-date. In our laboratory we have over 20-year experience with osmium tetroxide complexes (Os,L) covalently binding to unpaired pyrimidine (primarily thymine) residues in DNA. The Os,bipy-modified DNA provides spectra of faradaic signals on mercury and carbon electrodes and a highly sensitive catalytic peak on mercury. We have found out that the catalytic signal is possible to measure also with mercury film electrodes (MFE) and use these measurements for bioanalytical purposes. (Use of the MFE may be in some cases more suitable than use of HMDE.) For the pursposes of analysis we used so called double-surface method, in which the DNA hybridisation and detection take place on separated surfaces (paramagnetic particles resp. the electrode surface). By this way it was possible to optimise particular steps independently.We also tested a possibility of replacement of the well-tried bipy in Os,L by other ligands. We have found that various Os,Ls provide signals at different potentials depending on the choice of the ligand L. The potential diferrences were sufficient so it was possible to simultaneously hybridize DNA with several target sequences with signalling probes labeled by different Os,Ls. In addition, we performed preliminary test of the posibility of electrochemical detection of changes (mutations) in a nucleotide sequence involving thymine residues reacting with the Os,bipy. We succeeded to distinguish electrochemically DNA single-strands and hteroduplexes differing in only one nucleotide.

Klíčová slova

DNA, elektrochemie, hybridizace, bodové mutace, osmium DNA, electrochemistry, hybridisation, point mutation, osmium

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 18. 10. 2007

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 18. 10. 2007
• Vedoucí: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.
• Oponent: prof. RNDr. Libuše Trnková, CSc., RNDr. Karolína Pecková, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Fyzika (čtyřleté) / Biofyzika