Interaction of proteins with plasmachemically prepared surfaces

Ekaterina Makhneva, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Biosenzory jsou intenzivně vyvíjeny a využívány pro biomedicínské a environmentální studie. Metody křemenných krystalových mikrovah (QCM) a povrchové plasmonové resonance (SPR) se ukázaly jako velice slibné nástroje pro citlivou detekci různých antigenů a bakterií. Pro vývoj účinných biosenzorů je vždy nutná imobilizace biorekognitivních biomolekul na povrchu senzoru. Povlaky obsahující karboxylové a aminové skupiny mají velký význam pro biologické aplikace díky jejich vysoké reaktivitě umožňující tvorbu kovalentních vazeb mezi biomolekulami a povrchem. Pro většinu aplikací je nutná dostatečně vysoká povrchová koncentrace funkčních skupin, stejně jako stabilita vrstvy v roztocích s různým pH. V této práci byly v různých typech výbojů za nízkého nebo atmosférického tlaku připraveny stabilní plazmové polymery (PP) bohaté na aminy nebo karboxyly. Chemické složení, vlastnosti a stabilita PP byly zkoumány pomocí elipsometrie, změn intenzit charakteristických absorpčních píků v infračervené oblasti a změn složení určeného pomocí rentgenové fotoelektronové spektroskopie (XPS). Koncentrace funkčních skupin byly stanoveny chemickou derivatizací doprovázenou XPS analýzou. Bylo ukázáno, že PP jsou vysoce reaktivní vrstvy s různými jedinečnými funkčními schopnostmi a vynikající mírou adheze k substrátům. PP vykazovaly dobrou stabilitu ve vodě a fosfátovém pufru s chloridem sodným (PBS), protože ztráta tloušťky vrstvy byla maximálně 20%. Infračervená spektroskopie ukázala, že ponoření do vody nebo PBS vede nejen ke ztrátě tloušťky, ale i k chemické reorganizaci ve vrstvách. Byl zjištěn obecný trend, že po 24 hodinách ponoření do vodního prostředí se PP neprojeví žádné další významné změny tloušťky (měření bylo provedeno až po dobu 216 hodin ponoření do vody a PBS). Stabilní aminové a karboxylové PP byly také deponovány na zlatý povrch QCM a SPR čipů. Na povrch byla imobilizována monoklonální protilátka AL-01, specifická pro lidský sérový albumin (HSA), a odezva imunosenzorů byla hodnoceny testem na reakci protilátky v průtokovém režimu (immunoassay). Připravené senzory vykazovaly vysokou úroveň stability a poskytovaly selektivní a výraznou odezvu na roztoky protilátky HSA. Mez citlivosti senzorů (LOD) byla 1 μg/ml aminové PP a 0,1 μg/ml pro karboxylové PP. Rovněž byla provedena detekce bakterií Salmonella a bylo dosaženo LOD 105 CFU/ml u obou typů PP. Mez citlivosti byla srovnatelná s rozšířeně užívanou metodou ELISA a dalšími metodami „label-free“ detekce pomocí samouspořádaných monovrstev (SAM). Úspěšně byla aplikována regenerace pomocí 10 mM NaOH v případě PP bohatých na aminy nebo pomocí 10 mM HC1 pro PP bohaté na karboxyly, a to umožnilo provádět několik měření (7-9) s jediným krystalem nebo čipem. V práci bylo tedy ukázáno, že plazmová polymerizace je účinnou alternativou přípravy vrstev pro imobilizaci různých proteinů a tato účinná a životní prostředí nezatěžující metodika může být použita pro přípravu vrstev v imunosenzorech místo metodiky SAM.

Abstract:

Biosensors have been extensively developed and applied for biomedical and environmental studies. Quartz crystal microbalance (QCM) and surface plasmon resonance (SPR) biosensors appeared to be very promising tools regarding the sensitive determination of various antigens (Ags) and bacteria. For the development of effective biosensors, the immobilization of the biorecognition biomolecules onto the sensor surface is always required. Carboxyl and amine coatings are of high interest for bioapplications thanks to their high reactivity allowing the formation of the covalent linkages between biomolecules and a surface. For most applications, a sufficiently high surface concentration of functional groups as well as the layer stability under solutions of various pH is required. In this thesis, stable amine-rich and carboxyl-rich plasma polymers (PPs) were deposited using plasma polymerization in different set-ups at low or atmospheric pressure. Chemical composition, properties and stability of PPs were investigated by ellipsometric measurements, changes in the characteristic infrared absorption peaks and composition changes visualized by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). Concentrations of functional groups were determined by chemical derivatization accompanied with XPS. It was shown that PPs are highly reactive compounds with a various unique functionality and an excellent level of adhesion to the substrates. PPs performed good level of stability in water and phosphate-buffered saline (PBS) with a 20% maximum thickness loss. The infrared spectroscopy showed that the immersion in water or PBS leads not only to the thickness loss but also to the chemical re-arrangement in the films. It was found that, in general, the PPs do not exhibit any further significant thickness losses after 24 h of immersion in aqueous environment (measurements up to 216 h of immersion in water and PBS). The stable amine and carboxyl-rich PPs were also deposited onto the gold surface of QCM electrodes and SPR chips. The monoclonal antibody (Ab) AL-01, specific to human serum albumin (HSA), was immobilized and the performance of QCM and SPR immunosensors was evaluated by the immunoassay flow test. The developed sensors performed high level of stability and provided selective and high response to the HSA Ag solutions. The limit of detection (LOD) was 1 µg/mL and 0,1 µg/mL for the amine and carboxyl PPs, respectively. Additionally, the detection of Salmonella bacteria was tested and the LOD of 105 CFU/mL was achieved for both the types of PPs. The limit of sensitivity was comparable to the widely used ELISA methods and other methods of label-free detection using self-assembled monolayers (SAMs). Regeneration by 10 mM NaOH (amine-rich PPs) or by 10 mM HCl (carboxyl-rich PPs) was successfully applied allowing several measurements (7-9) with the single crystal or chip. In conclusion, this thesis proved that PPs can be successfully employed as matrix layers for the immobilization of various proteins and, therefore, this methodology can be used as a powerful, eco-friendly and efficient method for the preparation of matrix layers in immunosensors, alternatively to SAMs.

Keywords

Plasma Polymerization, Amine-rich coating, Carboxyl-rich coating Immunosensor, QCM, SPR

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 23. 4. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 5. 6. 2018
• Vedoucí: doc. Mgr. Lenka Zajíčková, Ph.D.
• Oponent: dr. Katja Fricke, doc. Ing. Andrey Shukurov, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Pokročilé materiály a nanovědy / Pokročilé nanotechnologie a mikrotechnologie