Vliv průtoku v extracelulárním prostředí na biochemické procesy v buňkách

Mgr. Marek Černík, Ph.D.

Doctoral thesis

The effect of flow in extracellular space on the biochemical processes in the cells

Abstract:

Nepravidelnosti průtoku mohou v endoteliálních buňkách (EC) vyvolat prozánětlivý fenotyp, který je jednou z počátečních fází při vzniku kardiovaskulárních onemocně-ní (KVO). Mikrofluidní in vitro modely představují alternativu ke zvířecím modelům obvykle používaným pro výzkum KVO, protože umožňují kultivaci buněk ve fyziolo-gicky relevantním prostředí za kontrolovaných podmínek. V této práci byl navržen mikro-fluidní čip s kruhovým průřezem kanálků pro studium vlivu proudění na EC. Čip byl připraven z polydimethylsiloxanu (PDMS) pomocí 3D tištěné formy, aby byla zajištěna reprodukovatelná příprava čipů. Vnitřní povrch kanálků čipu byl upraven pomocí vysokofrekvenčního a nízkotlakého vzduchového plazmového výboje v kombinaci s potažením kolagenem IV. Tato chemická úprava povrchu nám umožnila opakovaně získat monovrstvu EC s vysokou viabilitou. Buňky vykazovaly fyziologic-ké chování, jelikož byly orientovány a prodlouženy ve směru proudění. Mechanosenzory na EC reagují na vlastnosti proudění převodem mechanického signálu na biochemické intracelulární signály. Tato práce byla zaměřena na endote-liální glykokalyx (GLX) a diferenciační skupina 44 (CD44). GLX je ochranná vrstva, která pokrývá luminální povrch EC a je primárním místem interakce prozánětlivých mediátorů s EC. CD44 je povrchový buněčný receptor, který interaguje s glykosami-noglykany (GAG), které jsou důležitou strukturní složkou GLX. Bylo prokázáno, že CD44 má signalizační překryv s Hippo dráhou, která mimo jiné moduluje zánět v endotelu. Nedávno bylo prokázáno, že myeloperoxidáza (MPO), prozánětlivý mediátor uvolňovaný leukocyty, destabilizuje GLX. Zjistili jsme, že destabilizace GLX indukova-ná MPO je způsobena kombinací enzymatické aktivity MPO a interakce s GAG, která je závislá na náboji. MPO vyvolala zvýšenou propustnost endoteliální monovrstvy a zvýšenou expresi prozánětlivých markerů. Dále jsme prokázali, že jak snížení aktivity CD44, tak deplece jeho ligandů způ-sobily deaktivaci Hippo dráhy. Stimulace CD44 by tedy mohla být terapeutickým pří-stupem k potlačení prozánětlivého fenotypu vyvolaného neaktivní Hippo dráhou.

Abstract:

Irregularities of flow can induce a proinflammatory phenotype in endothelial cells (ECs) which is one of the initial stages in the development of cardiovascular diseases (CVD). Microfluidic in vitro models provide an alternative to animal models typically used for CVD research because they enable cell cultivation in the physiologically relevant environment under controlled conditions. In this thesis, a microfluidic chip with a circular cross-section of the channels was designed to study the effect of flow on ECs. The chip was prepared from polydimethylsiloxane (PDMS) using the 3D printed mould to secure reproducible preparation of chips. The inner surface of chip channels was modified using high-frequency and low-pressure air plasma dis-charge combined with collagen IV coating. This surface chemistry allowed us to re-peatably obtain a highly viable monolayer of ECs. Cells showed physiological behav-iour as they were oriented and elongated in the direction of the flow. Mechanosensors on ECs respond to the flow characteristics by transducing a mechanical signal into biochemical intracellular signals. This thesis was focused on endothelial glycocalyx (GLX) and Cluster of Differentiation 44 (CD44). GLX is a pro-tective layer that covers the luminal surface of ECs and is the primary site of the proinflammatory mediators' interaction with ECs. CD44 is a cell surface receptor that interacts with glycosaminoglycans (GAGs), which are an important structural component of GLX. It has been demonstrated that CD44 engages in signalling cross-talk with the Hippo pathway, which among other functions modulates inflammation in endothelium. Recently, myeloperoxidase (MPO), a proinflammatory mediator released by leukocytes, was shown to destabilize the GLX. We discovered that MPO-induced de-stabilization of GLX is caused by a combination of MPO´s enzymatic activity and charge-dependent interaction with GAGs. MPO induced an increased endothelial monolayer permeability and increased expression of proinflammatory markers. Furthermore, we demonstrated that both reducing the activity of CD44 and de-pleting its ligands caused Hippo pathway deactivation. Hence stimulation of CD44 could be a therapeutic approach to subvert the proinflammatory phenotype induced by an inactive Hippo pathway.

Keywords

mikrofluidika, endothelium, CD44, Hippo signální dráha, microfluidics, Hippo pathway

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 9. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 16. 10. 2023
• Supervisor: Mgr. Jan Víteček, Ph.D.
• Reader: doc. MUDr. Aleš Hejčl, Ph.D., doc. Ing. Roman Matějka, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry