Klasifikace grampozitivních bakterií s využitím MALDI-TOF MS

Mgr. Tereza Balážová, Ph.D.

Disertační práce

The classification of Gram-positive bacteria with the use of MALDI-TOF MS

Anotace:

Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF je v mikrobiologii široce využívána pro charakterizaci, identifikaci a klasifikaci mikroorganizmů na základě jejich peptidových/proteinových profilů. Vzhledem ke své rozlišovací schopnosti, citlivosti, rychlosti a přesnosti je metoda vhodná i pro rutinní použití v klinických laboratořích. Proces identifikace bakterie od přípravy vzorku po vyhodnocení typického proteinového „fingerprintu“ trvá jen několik minut a vyžaduje minimum chemikálií. Nízké náklady a rychlost analýzy jsou jedněmi z hlavních výhod metody ve srovnání s konvenčními metodami identifikace bakterií. Disertační práce je sestavena z teoretické rešerše, čtyř komentovaných publikací a výsledků několika nepublikovaných výzkumů. Hlavním cílem práce bylo nalezení vhodného postupu pro diferenciaci kmenů vybraných klinicky významných grampozitivních bakterií. Za tímto účelem jsme navrhli metodu založenou na kombinaci zrychlené enzymatické digesce buněk a MALDI-TOF MS analýzy, která umožnila spolehlivé rozlišení kmenů Staphylococcus aureus a Staphylococcus haemolyticus a zlepšila diferenciaci ekotypů Bacillus subtilis. Mezi další záměry práce patřilo ověření vlivu kultivačních podmínek a metod přípravy vzorků na výstupy analýzy a optimalizace využití MALDI-TOF MS pro charakterizaci bakteriálních taxonů z různých zdrojů zahrnující klinicky, potravinářsky i environmentálně významné bakterie. Na souboru rychle rostoucích mykobakterií kultivovaných za různých podmínek jsme otestovali dva nedávno publikované postupy inaktivace buněk a extrakce proteinů. Zjistili jsme, že růstové podmínky a příprava vzorků k analýze mohou výrazně ovlivnit kvalitu charakteristických bakteriálních hmotnostních spekter a úspěšnost identifikace. Za specifických kultivačních podmínek jsme u M. phlei dosáhli kmenové diferenciace. Pozorované efekty byly druhově specifické. Aplikovatelnost MALDI-TOF MS analýzy na identifikaci anaerobních bakterií figurujících jako typické kontaminanty v procesu výroby piva byla ověřena na izolátech získaných z Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského v Praze. Součástí studie byl i pokus o přímou identifikaci kontaminant ze vzorků biofilmů odebraných ve stáčírně lahví. Identifikační schopnost metody jsme zvýšili rozšířením referenční databáze a dosáhli tak takřka dvakrát vyšší míry identifikace na úroveň druhu. Analýza rozsáhlého souboru aeromonád včetně nových, nedávno popsaných druhů ukázala, že v případě příliš velké podobnosti spekter druhů v rámci rodu není MALDI-TOF MS zcela spolehlivým identifikačním nástrojem. Identifikace nových druhů (včetně patogenních agens), které zatím nejsou obsaženy v referenční databázi, byla doprovázena ziskem řady falešně pozitivních výsledků.

Abstract:

MALDI-TOF mass spectrometry is widely used in microbiology as a tool for microbial characterization, identification and classification on the basis of bacterial peptide/protein profiles. Due to its discriminatory power, sensitivity, rapidity and accuracy, the method is well adapted to routine use in the clinical laboratories. The entire identification process, from sample preparation to interpretation of the protein fingerprint, takes only few minutes and requires a minimum of chemicals, resulting in low costs of whole analysis as compared to conventional bacteria identification methods. The dissertation thesis is composed of overview of the topic, four commented publications and the results of unpublished research. The main aim of our study was finding of a suitable method for the strain differentiation of selected clinically important Gram-positive bacteria. For this purpose, we proposed a method based on a combination of accelerated enzymatic digestion of cells followed by MALDI-TOF MS analysis, which allows a reliable distinguishing between Staphylococcus aureus and Staphylococcus haemolyticus strains and improved differentiation between Bacillus subtilis ecotypes. Another objectives of our work included the assessment of the influence of inactivation protocols and culture conditions on the analysis outputs, and optimization of the use of MALDI-TOF MS for characterization of bacterial taxa from various sources, including clinically and environmentally relevant bacteria, and bacteria from the food processing industry. We tested two recently published protocols for inactivation and disruption of mycobacteria, and we also examined the influence of different culture conditions. We found that the growth conditions and sample preparation method can greatly affect the quality of characteristic bacterial mass spectra and identification success rate. The specific culture conditions allowed discrimination between M. phlei strains. All observed effects were also found to be species specific. Applicability of MALDI-TOF MS analysis for identification of anaerobic bacteria present as typical contaminants in the process of beer production was examined on isolates obtained from the Research Institute of Brewing and Malting in Prague. We also tested possibility of direct bacteria identification from the biofilm samples taken at the beer filling halls. We improved identification success rate of the method (almost twice at the species level) by extension of the database with home-made entries. We also analyzed a large set of of Aeromonas spp., including recently described ones, and we found that MALDI-TOF MS is not a reliable diagnostic technique for aeromonads. The similarity between mass spectra caused high percentage of false-positive identification results, especially in the case of newly described species (including pathogens).

Klíčová slova

MALDI-TOF MS, Staphylococcus, Bacillus, Mycobacterium, Pectinatus, Aeromonas, Biotyper, profilování bakterií, hmotnostní spektrum, kmenová diferenciace, bacteria profiling, mass spectrum, strain differentiation

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 1. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 20. 2. 2015
• Vedoucí: Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D.
• Oponent: Ing. Petr Halada, Ph.D., doc. Mgr. Jan Havliš, Dr., prof. Ing. Lenka Hernychová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Mikrobiologie