Charakterizace PCNA zprostředkovaných interakcí při opravě dvouřetězcových zlomů v DNA

Bc. Alexandra Sisáková, Ph.D.

Master's thesis

Characterization of PCNA mediate interactions in the DNA double-strand break repair

Abstract:

The most toxic forms of DNA damage are DSBs, which once left unrepaired, can kill the cell. During evolution several pathways appeared to cope with this problem: the non-homologous end joining, homologous recombination (HR) and single strand annealing. Homologous recombination (HR) plays a key role in the elimination of DSBs. In our laboratory we are trying to understand the molecular mechanism of this pathway. In my diploma thesis we focused on PCNA mediated interactions involved in HR. By in silico analysis we found an interaction motif in the sequence of Rad54p and Mus81p, which are factors involved in the DSBs repair pathway. This led us to study these interactions more in detail. We comfirmed the interaction between PCNA and Rad54p as well as between PCNA and Mus81/Mms4 by in vitro and in vivo techniques. We also showed that these interactions are mediated by PIP-box motif in Rad54p and Mus81p. In the case of PCNA-Rad54p interaction we were not able to find out the biological function of this interaction, because the mutant Rad54-AA lacks the enzymatic activity, and it was not able to rescue Δrad54 phenotype. This led us to prepair another mutant form of Rad54p, that should retain its ATP-ase activity.

Abstract:

Kľúčovým procesom pri eliminácii DSBs je homológna rekombinácia. Tento proces vyžaduje prítomnosť mnohých faktorov, medzi ktoré patrí aj PCNA, ktorý plní úlohu procesivitného faktora eukaryotických polymeráz a zúčastňuje sa tak syntézy chýbajúceho úseku poškodenej molekuly DNA. Nakoľko in silico analýzou bol zistený interakčný motív (PIP-box) pre PCNA u Rad54p ako aj komplexu Mus81/Mms4, faktorov, ktoré sa zúčastňujú opravy DSBs v HR, cieľom tejto diplomovej práce bolo potvrdiť tieto tieto interakcie ako aj porozumieť ich biologickému významu. Interakcia PCNA s Rad54 aj Mus81/Mms4 bola in vivo a tiez in vitro potvrdená. V prípade Rad54p bola dokázaná experimentami s mutantnou formou Rad54-AA nevyhnutnosť PIP-box motívu pre väzbu s PCNA a takisto bolo zistené, že PCNA má pre interakciu s Rad54p pravdepodobne viac väzbových motívov. Nakoľko sa ukázalo, že je Rad54p-AA ATP-ázovo deficientý, nebolo možné popísať biologický význam tejto interakcie. Za týmto účelom bol generovaný mutant Rad54, u ktorého existuje predpoklad zachovania ATP-ázovej aktivity za súčasnej straty interakcie s PCNA. V prípade experimentov PCNA a Mus81/Mms4 nebolo možné purifikovať mutantnú formu, ktorá by niesla mutáciu v PIP-box motíve. Nevyhnutnosť tohto interakčného miesta však bola potvrdená experimentami s krátkymi peptidmi pFF a pAA. Pomocou nukleázovej eseje s komplexom Mus81/Mms4 bol pozorovaný stimulačný efekt PCNA na jeho endonukleázovú aktivitu.

Kľúčové slová

homologní rekombinace HR, dvouřetězcové zlomy DSB, proliferačný jadrový antigen (PCNA), protein Rad54, komplex Mus81/Mms4

Jazyk práce: Slovak

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 17. 6. 2010
• Vedúci: doc. Mgr. Lumír Krejčí, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biology / Molecular Biology and Genetics