Analýza chybovosti SSR markerů u psů a vlků

Yekaterina Polyanskaya

Master's thesis

Estimation of Genotyping Error of SSR Markers in Dogs and Wolves

Abstract:

Canis familiaris (pes domácí) se dnes považuje, ze všech domácích zvířat, za zvíře člověku citově nejbližší. Mhohé studie uvádí, že pes pochází z vlka,a že se vlci a psi rozdělili do různých druhů zhruba před 100 000 lety. Uvádí se, že vlk (Canis lupus) je jediný předchůdce psa domácího. Na základě své genetické podoby byli vlk a pes vybráni pro účely této diplomové práce jako objekt pro analýzu s využitím STR lokusů.Mikrosatelity (STR) jsou široce využívány v různých molekulárních analýzách DNA jako klasické genetické markery, jelikož jsou polymorfní a snadno detekovatelné pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) za použití fluorescenčně značených primerů a laserového detekčního systému. STR jsou tvořeny z několikrát se opakujících motivů o délce 1- 6 bází. V experimentální části teto diplomové práce byl využit mikrosatelitní systém Mini - DogFiler, který obsahuje 11 mikrosatelitních markerů rozdelených do dvou panelů (Panel A: K9 SRY, VGL1063, VGL2136, VGL1541, VGL1165, VGL1828, VGL2409, panel B: VGL3008, VGL3438, VGL2009, VGL3112, VGL1606) dle Wictum et al. (2013).Nejprve byly provedeny nezávislé izolace DNA z bukálních stěrů a exkrementů. Pro analýzu byly získány vzorky 170 psů plemene československý vlčák (Canis lupus familiaris) a 39 vzorků vlka euroasijského (Canis lupus lupus). Dále na základě koncentrace primerů, celkového reakčního objemu, koncentrace DNA a počtu cyklů v PCR reakci byl optimalizován vhodný mikrosatelitní systém. Vybrané genotypy byly testovány prostřednictvím multiplex PCR a kapilární elektroforézy a provedeny 4 opakovaná genotypování. Celkem bylo detekováno 73 různých alel v 11 lokusech, pro samotné československé vlčáky bylo detekováno 67 různých alel v 11 lokusech, a u vlků bylo nalezeno 31 alel v 11 lokusech. V průběhu genotypovacího procesu byly zaznamenány prakticky všechny jevy, které mohou být zdrojem chyb, jako jsou kontaminace enviromentálního DNA vzorku, alelický drop-out, PCR artefakty či technická nulová alela. Pro vyhodnocení genetické diverzity vybraných psích plemen/vlků a určení základních populačních parametrů bylo použito nekolik programů.Zjištěné poznatky ukazují na vysokou rozlišovací sílu výbraného mikrosatelitního systému a na velmi nízkou chybovost.

Abstract:

Canis familiaris (domestic dog) for today is considered as the most emotionally intimate animal. Various studies indicate that the dog comes from a wolf, and that the wolf and the dog are divided into different species about 100,000 years ago. It is also believed that the wolf is the only predecessor of the dog. Therefore, on the basis of its genetic similarity, the dog and the wolf were selected to be the research objectives of this degree work using STR loci.Microsatellites (STR) are commenly used classic genetic markers in molecular DNA analysis because they are easily detectable by polymerase chain reaction using stained primers and a laser system. STR consist of repeated motives and have a length of 1 - 6 base pair. The microsatellites system was used in the experimental part of this thesis, which consists of 11 microsatellite markers, divided into two panel panels.In the beginning, DNA was isolated from the excrement and swab test has done. The analysis was carried out on DNA samples of 170 Czechoslovakian wolf dog breed and 39 DNA samples of the Eurasian wolf. Further, a suitable microsatellite system was optimized based on the primer concentration, the volume of the reaction mixture, the DNA concentration, and the number of cycles. The selected genotypes were tested using multiplex PCR and capillary electrophoresis and four repetitive genotyping were carried out.In total, 73 different allels were detected in 11 loci, among the Czechoslovakian dogs 67 different allels in 11 loci, the wolves found 31 alleles in 11 loci.During genotyping process errors has been reported alomost in all phenomena that can be in error sources. These include the contamination of enviromental DNA samples, allelic dropout, PCR artefacts, zero allele. For evaluating the genetic diversity of selected breeds of dogs and wolves and determining the population parameters, several software programs were used.The obtained results indicated a high distinctive ability of the microsatellite system and a low Genotyping Error.

Keywords

Canis lupus, mikrosatelity, multiplex PCR, genotypování, Candidae, Canis familiaris, fylogenetický původ, kapilární elektroforéza, chybovost

Keywords

Candidae, genotyping, multiplex PCR, capillary electrophoresis, errors, Canis familiaris, Сanis Lupus, phylogeny, microsatellites

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 4. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Jakub Vašek, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Biotechnology and Animal Breeding