Spojení separačních technik s hmotnostní spektrometrií v analýze flavonoidů a produktů jejich biotransformace

Mgr. Renáta MYJAVCOVÁ

Doctoral thesis

Combination of separation techniques with mass spectrometry in analysis of flavonoids and products of their (bio)transformation.

Abstract:

Flavonoidy jsou rozsáhlou biologicky významnou skupinou látek. Důvodů zájmu o detailní zkoumání těchto přírodních látek je několik. Především je to jejich využití v medicíně jako prevence proti kardiovaskulárním onemocněním, cukrovce (diabetes mellitus 2. typu), onemocněním centrální nervové soustavy (CNS) a také potenciálně i při léčbě rakoviny. Anthokyaniny jsou přírodní barviva patřící do skupiny flavonoidů. Tato barviva hrají významnou roli v životě rostlin - ochrana pletiv před UV zářením a predátory, přitahování opylovačů atd. Anthokyaniny jsou poměrně málo stabilní. Snadno se oxidují, hydrolyzují a rovněž kondenzují na složitější barviva. Produkty vznikající jejich kondenzací s malými reaktivními sloučeninami, jako jsou pyrohroznová kyselina, acetaldehyd, aceton a další jsou už výrazně stabilnější a lze je využít v řadě oblastí, zejména potravinářství. U vzniklých kondenzovaných barviv lze očekávat jinou biologickou aktivitu v lidském organismu, než jakou vykazují samotné anthokyaniny. V této disertační práci byla pozornost věnována jedné skupině derivátů anthokyaninů - pyranoanthokyaninům. Byla studována jejich tvorba v extraktech plodů zimolezu kamčatského během jeho testování pro využití v potravinových doplňcích. Detailní pozornost byla věnována analytickým vlastnostem 5-methylpyranoanthokyaninů. Byla prostudována fragmentace tohoto barviva po kolizí indukované disociaci v iontové pasti. Kromě odštěpování oxidu uhelnatého a vody byl v kolizních spektrech pozorovány i fragmenty vznikající odštěpením methylového radikálu z pyrano-kruhu. Tyto fragmenty jsou pro 5-methylpyranoanthokyaniny charakteristické a mohou být analyticky využity. Lidský metabolismus je souborem biochemických reakcí probíhajících v buňkách. Nejčastěji jsou metabolické děje studovány na jaterních a střevních buňkách. Metabolismus anthokyaninových barviv byl již v literatuře do určité míry studován. O metabolismu derivátů anthokyaninů je toho však známo velmi málo. Studium in vitro biotransformace vybraného pyranoanthokyanidinu bylo také předmětem této disertační práce. Pro tyto experimenty byl vybrán 5-methylpyranopelargonidin. V paralelních experimentech byly spolu s tímto barvivem studovány i pelargonidin (nejjednodušší anthokyanidin) a kvercetin (běžný a dobře prostudovaný flavonoid). Byly použity nádorové linie jaterních a střevních buněk (HepG2 a LS174T). Po proběhnutí biotransformace byly vzniklé metabolity analyzovány pomocí spojení ultraúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (UHPLC/MS). U kvercetinu byly pozorovány běžné metabolity fáze I a II. Při analýze buněčného sedimentu (pelet) byly navíc nalezeny ionty metabolitů s hodnotou m/z 603,0789 a 905,1212 ([M-H]- ionty). Tyto ionty byly připsány dimeru a trimeru kvercetinu. Obě studovaná barviva (pelargonidin a 5-methylpyranopelargonidin) metabolizovala méně ochotně než kvercetin. Biotransformace 5-methylpyranopelaronidinu probíhala s větším výtěžkem metabolitů než biotransformace pelargonidinu. Studovaný 5-methylpyranoanthokyanin se od ostatních dvou studovaných látek významně liší i v profilu metabolitů akumulovaných v buněčných sedimentech. To zřejmě souvisí s přítomností jednoho kruhu a methylu navíc v molekule pyrano-barviva oproti srovnávaným látkám a tedy s jeho vyšší hydrofobicitou.

Abstract:

Flavonoids represent a wide group of biologically important compounds. There are several reasons for interest in the detailed investigation of these natural compounds. Especially, their use in medicine to prevent cardiovascular disease, diabetes (type 2 diabetes mellitus), central nervous system disorders (CNS) and also the potential in cancer treatment can be mentioned. Anthocyanins are natural dyes belonging among flavonoids. Those dyes play important role in plant life - protection of plant tissues against UV radiation and predators and attraction of pollinators etc. Anthocyanins are relatively unstable. Oxidation, hydrolysis and formation of more complex dyes (condensation) are the most frequent processes. Product arising by condensation with some small reactive compounds, such a pyruvic acid, acetaldehyde, acetone and other are much stable and they can be used in many areas, first of all in food industry. Different biological activity of condensed dyes can be expected compared to native anthocyanins. This thesis is focused on one group of anthocyanin derivatives - pyranoanthocyanins. Their formation was studied in fruit extract of honeysuckle in the framework of their utilization in food supplements. Analytical properties of 5-methylpyranoanthocyanins were studied in detail, especially fragmentation after collision induced dissociation in ion trap. Besides general cleavage of carbon monoxide and water, the cleavage of the methyl radical from pyrano ring was observed in collision spectra. Some of observed fragments can be used as diagnostic ions for identification of 5-methylpyranoanthocyanins in real samples. Human metabolism is a complex of biochemical reactions proceed in cells. The metabolic processes are mainly studied in the liver and intestinal cells. Metabolism of anthocyanin dyes was described in the literature for several times. However relevant information about metabolism of pyranoanthocyanins and other complex anthocyanin dyes is missing. Biotransformation of pyranoanthocyanins represents second topic of this thesis. 5-methylpyranoanthocyanin, pelargonidin (related anthocyanidin) and quercetin (common and well studied flavonoid) were in vitro metabolized with tumor lines of liver and intestinal cells (LS174T and HepG2). Arised metabolites were analyzed using ultra performance liquid chromatography hyphenated with mass spectrometry (UHPLC/MS). Common and in former literature described metabolites of quercetin of phase I and II were observed (showing that the used cells were metabolically active). In the cell sediment metabolites with a m/z 603,0789 and 905,1212 ([M H]- ions) were also found. These ions were tentatively attributed to dimer and trimer of quercetin. Both studied dyes (pelargonidin a 5-methylpyranopelargonidin) metabolized less readily than quercetin. Biotransformation of 5-methylpyranopelargonidin proceeded with higher yield of metabolites compared to pelargonidin. Studied 5-methylpyranoanthocyanin differed significantly from the other compounds also in the profile of metabolites accumulated in cell pellets. This may be related to the presence of one additional ring and methyl group in the molecule of pyrano dyes and thus its higher hydrophobicity.

Keywords

flavonoid, anthokyanin, pyranoanthokyanin, LC/MS, UHPLC/MS, metabolit

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2015

Accessible from:: 27. 4. 2015

Thesis defence

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry