Lektiny podílející se na specifickém rozpoznávání patogenních bakterií

Mgr. Martina Pokorná, Ph.D.

Disertační práce

Lectins participating in specific host pathogen recognition

Anotace:

Disertační práce se zabývá lektiny z patogenních bakterií Pseudomonas aeruginosa a Chromobacterium violaceum. Obě tyto bakterie patří k podmíněným lidským patogenům. U jedince se sníženou imunitou, P. aeruginosa může infikovat téměř jakýkoliv lidský orgán, a chronické plicní infekce touto bakterií jsou hlavní příčinou úmrtnosti pacientů s cystickou fibrosou. Také bakterie C. violacemu může způsobovat onemocnění u jedinců s oslabeným imunitním systémem. Hlavním cílem této disertační práce byla příprava rekombinantních proteinů z těchto bakterií a jejich další strukturně funkční charakterizace. Lektiny z bakterie Pseudomonas aeruginosa, PA-IL a PA-IIL, byly připraveny v rekombinantní podobě a PA-IIL lektin byl detailně charakterizován. K nejvýznamnějším výsledkům patří charakterizace interakce mezi lektinem PA-IIL a různými monosacharidy a oligosacharidy pomocí izotermální titrační kalorimetrie (ITC) a ELLA metody (Enzyme-Linked lectin assay). Za zvláštní zmínku stojí stanovení termodynamických a kinetických parametrů pro vazbu PA-IIL lektinu s některými fukosylovanými oligosacharidy přítomnými v lidském mléce, protože tyto oligosacharidy mohou inhibovat vazbu patogenních bakterií nebo virů k epiteliálním strukturám. Kombinací několika metod (krystalografie, ITC mikrokalorimetrie a počítačové modelování) se podařilo se vysvětlit podstatu neobvykle vysoké afinity lektinu PA-IIL k monosacharidům, která se pohybuje v mikromolární oblasti, zatímco pro lektiny je obvykle typická oblast milimolárních afinit. Díky této neobvykle vysoké afinitě lektinu PA-IIL k monosacharidům nás velmi zajímá detailnější popis vazebného místa. Z toho důvodu byl připraven a krystalován plně deuterovaný protein PA-IIL. Dosud získané krystaly nedostačují svojí velikostí pro neutronovou difrakci a experimenty pro získání dostatečně velkého krystalu stále pokračují. Prohledáváním databází byl nalezen homologní protein lektinu PA-IIL v bakterii Chromobacterium violaceum, CV-IIL lektin. Protein CV-IIL byl pro termodynamickou charakterizaci vazby s některými monosacharidy (s využitím ITC mikrokalorimetrie) připraven v rekombinantní podobě. Pro detailnější popis interakce lektinu CV-IIL s 214 různými oligosacharidy byla použita metoda microarray na mikrotitračních destičkách. Krystalová struktura lektinu CV-IIL s různými monosacharidy potvrdila vyšší adaptabilitu lektinu pro vazbu manosylovaných sacharidů ve srovnání s lektinem PA-IIL. Bylo také potvrzeno, že CV-IIL lektin je v nativní podobě přímo produkován pigmentující baktérií Chromobacterium violaceum. Díky popisu vazebného místa jednoho z homologů lektinu PA-IIL, lektinu RS-IIL z bakterie Ralstonia solanacearum [90], byl nalezen motiv tří aminokyselin v pozicích 22-24, který má zásadní vliv na sacharidovou specifitu lektinů podobných PA-IIL. V těchto pozicích byly proto u PA-IIL navrženy mutace. Ukázalo se, že mutace v pozici 22 má zásadní vliv na specifitu PA-IIL lektinu, zatímco mutace v pozici 23 a 24 mají vliv jen nepatrný a přispívají k výsledné afinitě k interagujícím monosacharidům. Lektiny PA-IIL a CV-IIL prezentují dva členy velmi zajímavé skupiny lektinů vázajících vápenaté ionty. Detailnější popis interakce těchto lektinů se sacharidy nám může pomoci lépe porozumět jejich funkci v biologických dějích.

Abstract:

The presented Ph.D. thesis is focused on lectins from pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa and Chromobacterium violaceum. Both are human opportunistic pathogens. P. aeruginosa can infect almost every human tissue if immunity barriers are lowered and chronic lung colonisation by the bacterium is the major cause of morbidity and mortality in cystic fibrosis patients. C. violaceum can also cause diseases in immunocompromised individuals. The main goal of this project was preparation of lectins from these bacteria in recombinant form and their structure-function characterization. Lectins from Pseudomonas aeruginosa, PA-IL and PA-IIL have been prepared as recombinant proteins and PA-IIL lectin was characterized in detail. The most exciting results could be highlighted. The thermodynamics and kinetics parameters of the interaction between PA-IIL and different monosaccharides as well as some oligosaccharides, have been measured using ITC microcalorimetry and ELLA method. Especially, determination of these parameters and structure for PA-IIL and some human milk oligosaccharides should be mentioned, because these oligosaccharides can competitively inhibit the binding of pathogenic bacteria and viruses to epithelial ligands. It was possible to rationalized the unusually high affinity of PA-IIL for fucose, which is in micromolar range, although other lectins have affinity constant in milimolar range, by combination of several methods (crystallography, ITC and computational methods). Due to unusual high affinity of PA-IIL to monosaccharides we were interested in deeper view to the binding site, therefore perdeuterated PA-IIL have been prepared and crystallized. Unfortunately, the size of the crystals were not enough for neutron diffraction. Crystallization experiments still continue and are being optimized to obtain sufficiently large crystals. An unusual binding mode of PA-IIL lectin, mediated by two calcium ions has also been observed in crystal structure of CV-IIL lectin. The protein was prepared in recombinant form and thermodynamic characterization, using isothermal microcalorimery, of interaction with some monosaccharides has been done. More detailed characterization of interaction with 214 oligosaccharides was done by microarray in the microtitre plate. We have also confirmed that CV-IIL protein is presented in Chromobacterium violaceum in native form. Characterization of binding site of other homologue of PA-IIL lectin, RS-IIL, from Ralstonia solanacearum [90], showed an importance of the three-amino acid motif 22-24 determining fine specificity of PA-IIL like lectins. The mutation in this three-amino acid motif have been designed. It has been confirmed that mutation in position 22 noticeably change affinity and specificity of PA-IIL lectin. Mutations in position 23 and 24 had negligible significant influence on specificity and affinity. Lectins PA-IIL and CV-IIL represent two members of a very interesting family of calcium binding lectins. Detailed description of interaction with saccharides can help us to understanding to their functions in biological processes.

Keywords

lektin, Pseudomonas aeruginosa, patogen, oligosacharid, cystická fibrosa, Chromobacterium violaceum

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 26. 9. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 12. 10. 2006
• Vedoucí: prof. RNDr. Jaroslav Koča, DrSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie / Biomolekulární chemie