Studium molekulárních regulačních mechanismů pomocí proteomických technik

Mgr. Iva Procházková, Ph.D.

Doctoral thesis

The study of molecular regulation mechanisms using proteomics tools

Abstract:

Tato dizertační práce se zabývá proteomickými technikami, které byly využity pro odhalení molekulárních mechanismů biologických procesů. V teoretické části práce jsou popsány použité proteomické metody od metody dvojrozměrné elektroforézy přes necílenou proteomiku a konče současnými moderními postupy cílené proteomiky. Následuje stručný úvod týkající se biologické podstaty jednotlivých projektů: jedná se o bakterii Paracoccus denitrificans, protinádorová léčiva založená na platině a metastazování nádorů prsu. Druhá část práce je pojata jako komentovaný souhrn výsledků. V rámci prvního projektu jsme studovali proteinové složení 4 kmenů bakterie P. denitrificans (divoký kmen a 3 mutantní), které byly pěstovány za aerobních, semiaerobních a semiaerobních podmínek v přítomnosti dusičnanu. Účelem bylo odhalit centrální řídicí roli transkripčních faktorů z rodiny FNR za využití proteomiky a validace dat na úrovni transkriptu. Za využití dvojrozměrné elektroforézy byly získány expresní profily pro 737 proteinových spotů, ve kterých bylo pomocí hmotnostní spektrometrie identifikováno 640 proteinů. Výsledky ukázaly, že regulace za testovaných podmínek probíhá několika způsoby: (1) Regulace kontrolovaná proteinem FnrP (N2O reduktáza, proteiny UspA a OmpW). (2) Proteiny regulované dalšími regulátory včetně proteinů z regulonů NNR a NarR (β-podjednotka nitrát reduktázy, receptory závislé na TonB, nitrit reduktáza, transkripční regulátor typu TenA a neznámý protein z rodiny alfa/beta hydroláz. (3) Proteiny, jejichž exprese byla ovlivněna především růstovými podmínkami (SSU ribosomální protein S305 / σ54 modulační protein a dvě reduktázy/dehydrogenázy s krátkým řetězcem). Druhý projekt se zabývá studiem mechanismu účinku protinádorového léčiva LA-12. Cílem bylo identifikovat nové proteinové cíle této látky, jež by mohly sloužit jako markery léčby, odpovědi na léčbu a celkové monitorování terapie pomocí LA-12. Za využití povrchem usnadněné laserové desorpce/ionizace propojené s průletovým analyzátorem (SELDI-TOF) byly změřeny proteomické profily v potkaní plazmě. Byla vyhodnocena korelace 92 píků (proteinů/peptidů) ze SELDI-TOF spektra s koncentrací platiny, což vedlo k identifikaci retinol vázajícího proteinu 4 jako korelujícího s hladinou LA-12 u potkanů. Obdobné výsledky byly pozorovány i u náhodně vybraných pacientů, kteří se účastnili první fáze klinického testování. Indukce RBP4 je v souladu se známou regulací RBP4 amantadinem a cisplatinou. Jelikož je u mnohých nádorových onemocnění metabolismus retinolu narušen a spojen s malignitou nádoru, mohou naše data identifikovat nový potenciální mechanismus účinku LA-12 a dalších protinádorových léčiv. Třetí projekt byl zaměřen na odhalení proteinů souvisejících s metastazováním pacientek s nádorem prsu nízkého grade. Pomocí hmotnostně spektrometrické metody iTRAQ-2DLC-MS/MS jsme analyzovali sadu 96 primárních nádorů prsu. Na úrovni transkriptu bylo paralelně analyzováno 65 klíčových cílů a dalších 30 potencionálních markerů identifikovaných dříve a kontrolní markery. Určili jsme tak proteiny specificky asociované se zasažením lymfatických uzlin u nádorů nízkého grade, a dále proteiny asociované s dalšími klinickopatologickými parametry nádorů prsu. Zvýšená hladina některých možných biomarkerů u luminálních nádorů s postiženými lymfatickými uzlinami (versus bez postižení uzlin) byla validována analýzou genové exprese na nezávislém veřejně dostupném souboru. Naše výsledky naznačily unikátní pro-metastatický mechanismus u nádorů nízkého grade, který zahrnuje zvýšení hladiny karboxypeptidázy B1, aktivaci dráhy NF-κB a změny v proliferaci nádorových buněk

Abstract:

a jejich cytoskeletu. Čtvrtý projekt, jehož se týkají 2 komentované publikace, vychází ze třetího a cíleně se zaměřuje na 13 proteinů asociovaných s estrogenovým receptorem, nádorovým gradem a statusem lymfatických uzlin jako klíčovými faktory agresivity nádorů prsu. Zde byly změny v hladinách těchto proteinů verifikovány pomocí cílené proteomiky metodou monitorování vybraných reakcí s mTRAQ značeními, pomocí transkriptomiky a imunohistochemie a dále na 5 nezávislých sadách vzorků pomocí trankriptomiky. Výsledkem je panel genových produktů, které mohou přispívat k agresivitě nádorů prsu a metastazování. Tyto proteiny by po další úspěšné validaci mohly sloužit jako potenciální terapeutické či diagnostické cíle. Získané znalosti tak mohou přispět ke zlepšení terapie nádorů prsu. V souhrnu tato disertační práce ukazuje aplikace relevantních avšak odlišných proteomických přístupů k řešení několika aktuálních biologických a klinických otázek.

Abstract:

This dissertation thesis deals with proteomic techniques that help to uncover molecular mechanism of various biological processes. In the theoretical part, the proteomic methods used in the study are described starting from a two-dimensional electrophoresis through shotgun proteomics ending with modern methods of targeted proteomics. This is followed by a brief introduction into the particular projects concerning distinct biological organisms and phenomena (namely bacterium Paracoccus denitrificans, platinum based anti-tumour drugs, and breast cancer metastasis). The second part of the dissertation is represented by commented overview of the results. In the first project, we analyzed the protein composition of four strains (wild type and three mutant strains) of the bacterium P. denitrificans grown aerobically, semiaerobically and semiaerobically in the presence of nitrate to discover the global role of FNR-family transcription regulators using proteomics, with data validation at the transcript level. Expression profiles were acquired using two-dimensional gel electrophoresis for 737 protein spots, in which 640 proteins were identified using mass spectrometry. Our results revealed several types of regulation under the conditions tested: (1) FnrP-controlled regulation of nitrous oxide reductase, UspA and OmpW proteins. (2) Proteins regulated via additional regulators, including proteins involved in NNR and NarR regulons (nitrate reductase β-subunit, TonB-dependent receptors, nitrite reductase, TenA-type transcription regulator, and an unknown protein with an alpha/beta hydrolase fold). (3) Proteins whose expression was affected mainly by the growth condition (SSU ribosomal protein S305 / σ54 modulation protein, and two short-chain reductase–dehydrogenase proteins. The second project deals with the study of an anticancer agent known as LA-12. The objective of the study was to identify new LA-12 target proteins that serve as markers of LA-12 treatment, response and therapy monitoring. Proteomic profiles in rat plasma were measured by surface-enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF). Correlation of 92 peak clusters with platinum concentration was evaluated resulting in the identification of retinol-binding protein 4 whose level correlated with LA-12 level in treated rats. Similar results were observed in randomly selected patients involved in Phase I clinical trials. RBP4 induction is in agreement with known RBP4 regulation by amantadine and cisplatin. Since retinol metabolism is disrupted in many cancers and inversely associates with malignancy, these data identify a potential novel mechanism for the action of LA-12 and other similar anti-cancer drugs. In the third project we aimed to identify markers that would help to discriminate patients with low grade breast tumors. We employed iTRAQ-2DLC-MS/MS proteomics to a set of 96 primary breast tumors. The top 65 differentially expressed together with 30 previously identified and control markers were analyzed also at transcript level. We identified proteins associated specifically with lymph node positive low grade tumors, as well as proteins associated with other clinicopathological parameters of breast tumors. Upregulation of several putative biomarkers in lymph node positive (versus negative) luminal tumors was validated by gene expression analysis of an independent published data set. Our findings indicate unique pro-metastatic mechanisms in low grade tumors that can include up-regulation of carboxypeptidase B1, activation of NF-κB pathway and changes in cell survival and cytoskeleton. The fourth project, which resulted in two commented publications, follows the third one and targets 13 proteins associated with estrogen receptor, tumor grade and lymph node status, the key factors of breast cancer aggressiveness. Here we verified the changes in proteins levels using targeted proteomics based on selected reaction monitoring with mTRAQ la

Abstract:

beling, transcriptomics and immunohistochemistry and validated in 5 independent sets using transcriptomics. As a result, we highlight a panel of gene products that can contribute to breast cancer aggressiveness and metastasis. These proteins could, upon further successful validation, serve as potential therapeutic or diagnostic targets. These understandings can then potentially contribute to the improvement of breast cancer therapy. In a summary, the dissertation thesis shows applications of relevant but different proteomics approaches to solve several actual biological and clinical questions.

Keywords

proteomika, Paracoccus denitrificans, LA-12, nádory prsu, metastazování, cílená a necílená proteomika, biomarkery, proteomics, breast cancer, metastasis, targeted and shotgun proteomics, biomarkers

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 1. 8. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 17. 10. 2019
• Supervisor: doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Jiří Petrák, Ph.D., prof. Mgr. Marek Šebela, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biochemistry