Úloha izoenzymů v regulaci metabolismu sinic

MSc. Anushree BACHHAR

Doctoral thesis

Role of isoenzymes in metabolic regulation of cyanobacteria

Abstract:

Model cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 is one of the most studied species of cyanobacteria, having a significant impact in biotechnology, which explains why it is also known as "green E. coli". Experimental studies could deliver in vitro characterization of isozymes, but nobody knows if and how accurate such parametrization is in comparison to in vivo conditions. Also, despite the single/multi-mutant studies, the extent of isoenzymes roles is still lacking. The reasons behind this issue are: i) single knock-out is likely to be compensated by remaining isozyme(s), ii) deactivation of all isozymes does not count for unknown multi functionalities or iii) metabolic plasticity of Synechocystis allowing the redirection of metabolic flux towards alternative pathways within the central carbon metabolism, e.g., via glycolytic pathways (Embden-Meyerhof-Parnas pathway, Entner-Doudoroff pathway, phosphoketolase pathway and oxidative pentose phosphate pathway). In this study, I aimed to decipher some of the regulatory mechanisms within the central carbon metabolism of Synechocystis with the aid of metabolic model, integrating fluxomic, metabolic and transcriptomic data from literature and various databases e.g., Uniprot, KEGG. In the first half of my PhD research, I have focused on the impact of the mostly ignored glycolytic phosphoketolase pathway. In particular, we have shown that carbon flux via phosphoketolase pathway could be above 250% of the flux via Embden-Meyerhof-Parnas glycolysis under autotrophic conditions ambient CO2, thus playing a crucial role by mitigating the decarboxylation, i.e., carbon loss, occurring in other glycolytic pathways. We predicted that role of phosphoketolase pathway under mixotrophic conditions is rather negligible in Synechocystis, despite phosphoketolase pathway is crucial for heterotrophic conditions in most bacteria. In addition, we supported the existence of putative phosphoketolase isoenzyme (PKET 2) and quantified the following results under autotrophic conditions ambient CO2: 1) 17% flux reduction via RuBisCO for delta pket1 and 2) 11.2-14.3% growth decrease for delta pket2 in turbulent environment and 3) the substrate preference for phosphoketolase pathway under a given growth conditions. In the second half of my research work, I have focused on the recently confirmed glycolytic route in Synechocystis, the Entner-Doudoroff pathway (ED-P). Entner-Doudoroff pathway was previously concluded to be a very common (~92%) pathway among cyanobacteria, but my bioinformatic analysis based on available data sources predicted, Entner-Doudoroff pathway occurrence is below 50%. Interestingly, we have also identified plausible isozymes within Entner-Doudoroff pathway for some cyanobacteria. In the case of Synechocystis, we provided the first estimation of flux via Entner-Doudoroff pathway based on the growth impairment data which cannot be currently detected by 13C labelling experiments due to current detection limit for lower concentrations metabolite levels in mass-spectrometry devices. Nevertheless, we have identified too many uncertainties (enzyme multifunctionalities and identity issues) that it become difficult to annotate or predict the extent of possible metabolic and regulatory functions of Entner-Doudoroff pathway in Synechocystis.

Abstract:

Modelová sinice Synechocystis PCC 6803 je jedním z nejstudovanějších druhů sinic, který má významný podíl v biotechnologických aplikacích, což vysvětluje, proč se jí také říká "zelená E. coli". Experimentální studie mohou poskytnout in vitro charakterizaci isozymů, ale nikdo neví, zda a jak přesná je taková parametrizace ve srovnání se stavem in vivo. Také navzdory studiím s jedním/mnoha mutanty, stále plně neznáme rozsah rolí izoenzymů. Důvody, které stojí za tímto problémem, jsou: i) vyřazení jednoho izozymu je pravděpodobně kompenzováno zbývajícími izozymy, ii) deaktivace všech izozymu nepočítá s neznámou multifunkčností jiných enzymů nebo iii) metabolická plasticita Synechocystis umožňuje přesměrování metabolického toku na alternativní dráhy v rámci centrálního metabolismu uhlíku, např. prostřednictvím glykolytických drah (Embden-Meyerhof-Parnasova dráha, Entner-Doudorova dráha, fosfoketolázová dráha a oxidativní pentózofosfátová dráha). V této studii jsem se zaměřila na rozluštění některých regulačních mechanismů v rámci centrálního metabolismu uhlíku Synechocystis s pomocí metabolického modelu, který integruje fluxomické, metabolické a transkriptomické údaje z literatury a různých databází, např. Uniprot, KEGG. V první polovině svého doktorského výzkumu jsem se zaměřila na vliv většinou opomíjené glykolytické fosfoketolázové dráhy. Zejména jsme ukázali, že tok uhlíku cestou fosfoketolázy může dosáhnout 250 % toku přes Embden-Meyerhof-Parnas glykolýzu za autotrofních podmínek a úrovně CO2 okolního prostředí. Tedy, fosfoketolázová dráha hraje klíčovou roli tím, že zmírňuje dekarboxylaci, tj. ztráty uhlíku, ke kterým dochází v ostatních glykolytických cestách. Dále jsme předpověděli, že role fosfoketolázové dráhy za mixotrofních podmínek je u Synechocystis spíše zanedbatelná, přestože je tato dráha klíčová u většiny bakterií za heterotrofních podmínek. Kromě toho jsme potvrdili existenci předpokládaného izoenzymu fosfoketolázy (PKET 2) a kvantifikovali následující výsledky za autotrofních podmínek a úrovně CO2 okolního prostředí: 1) 17% snížení toku přes RuBisCO pro delta pket1 a 2) 11,2-14,3% snížení růstu pro delta pket2 v turbulentním prostředí a 3) preference substrátů pro fosfoketolázovou dráhu za daných růstových podmínek. V druhé polovině své výzkumné práce jsem se zaměřila na nedávno potvrzenou glykolytickou Entner-Doudoroffovu dráhu u Synechocystis. Entner-Doudoroffova dráha byla dříve považována za velmi běžnou (~92 %) mezi sinicemi, ale moje bioinformatická analýza na základě dostupných zdrojů dat předpověděla, že výskyt Entner-Doudoroffovy dráhy je nižší než 50 %. Zajímavé je, že jsme také identifikovali pravděpodobné izozymy v rámci Entner-Doudoroffovy dráhy u některých sinic. V případě Synechocystis jsme poskytli první odhad metabolického toku přes Entner-Doudoroffovu dráhu na základě údajů změn růstu při zablokování této dráhy; je zatím obtížné provést experimentální ověření s pomocí izotopu 13C vzhledem k současným limitům detekce velmi nízkých koncentrací metabolitů v přístrojích hmotnostní spektrometrie. Nicméně jsme zjistili příliš mnoho nejasností (multifunkčnost enzymů a problémy s identitou enzymů Entner-Doudoroffovy dráhy), takže je obtížné anotovat nebo předpovědět rozsah možných metabolických a regulačních funkcí Entner-Doudoroffovy dráhy u Synechocystis.

Keywords

Synechocystis PCC 6803, centrální metabolismus uhlíku, isoenzymy, kinetické modelování, multiomika.

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 3. 2023

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Jiří Jablonský, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Protection of Aquatic Ecosystems / Protection of Aquatic Ecosystems