Interakce lidských telomery chránících proteinů

Bc. Zuzana Dostálová

Master's thesis

Interactions of human proteins sheltering telomeres

Abstract:

Chromozomy jsou složeny z lineární DNA. Na koncích eukaryotických chromozomů se nacházejí nukleoproteinové struktury zvané telomery tvořené repeticemi lineární DNA o sekvenci TTAGGG a telomerickými proteiny. Během každého buněčného cyklu dochází ke ztrátě telomerové DNA až do kritické délky, při které dojde k senescenci a (nebo) apoptóze. V rychle dělících se buňkách, mezi něž patří kmenové, embryonální, ale také rakovinové buňky, přidává ribonukleoproteinový komplex telomeráza nukleotidy k telomerovým koncům. Shelterinový komplex, který se selektivně váže a chrání telomerovou DNA, se podílí na regulaci aktivity telomerázy. Shelterin je komplex šesti různých proteinů, který chrání konce chromozomů před interchromozomální fúzí, nežádoucí rekombinací, opravami a nukleolytickou degradací. Shelterin tudíž hraje zásadní roli v uchování genetické informace. Shelterinový protein “telomeric repeat-binding factor 2” (TRF2) reguluje aktivitu telomerázy tvorbou lasovitých struktur, které brání přístupu telomerázy a dalších proteinů. Další člen shelterinového komplexu, “repressor-activator protein 1” RAP1, zvyšuje selektivitu proteinu TRF2 k telomerové DNA a tvoří s ním multifunkční komplex, který hraje klíčovou roli v prevenci homologní opravy telomerové DNA. Dále telomerový protein TRF2 stabilizuje REST, čímž podporuje rakovinotvorné bujení. REST je represorem mnoha genů (obzvláště nervových) a může plnit protichůdné funkce; potlačovat tvorbu nádorů, ale také ji vyvolávat. Identifikace interakce mezi těmito dvěma proteiny by mohla napomoci k určení a bližšímu pochopení jejich rolí v kancerogenezi. Tato práce je zaměřena na popis interakce proteinu TRF2 s proteiny REST a RAP1, jejichž konstrukty byly exprimovány v Escherichia coli. Purifikované proteiny byly využi-ty k “pull-down” a EMSA experimentům. Kvantitativní analýzou za použití fluorescenční spektroskopie byla určena vzájemná vazebná afinita proteinů.

Abstract:

Chromosomes consist of linear DNA. The nucleoprotein structures at the ends of the eukaryotic chromosomes are called telomeres, which in vertebrates comprise repetitive sequences TTAGGG and telomere proteins. During every cell cycle, telomeric DNA shortens until the critical length is reached. Subsequently, senescence and (or) apoptosis processes take place. In fast-dividing cells, such as stem cells, embryonic cells, or cancer cells, a ribonucleoprotein complex called telomerase adds nucleotide repeats to telomeric DNA. The shelterin complex, which selectively binds and protects telomeric DNA, regulates the access and activity of telomerase. Shelterin consists of six protein subunits that protect the genome against interchromosomal fusion, undesired recombination, DNA repairs, and nucleolytic degradation. Shelterin is thus playing a vital role in the maintenance of genetic information. The shelterin protein that is responsible for the formation of loop structures which are restricting access of telomerase and other proteins is called telomeric repeat-binding factor 2 (TRF2). Another protein from the shelterin complex, repressor-activator protein 1 (RAP1), enhances TRF2’s selectivity to telomeric DNA, and creates a multifunctional complex with TRF2 which prevents homologous DNA repair. Additionally, TRF2 acts also as a stabilizer of non-telomeric protein – repressor element 1 silencing transcription factor (REST). REST represses the maturation of cancer stem cells and it this enhances the proliferation of cancer cells. The REST protein is a repressor of many especially neuronal gene. As REST it is involved in many counteracting processes, REST can suppress tumor development as well as tumor suppression. Identification of the interaction between REST and TRF2 might help to understand their roles in carcinogenesis. This thesis focuses on the description of the interaction of TRF2 with REST and RAP1. The protein constructs were expressed in Escherichia coli. Purified proteins were used for the pull-down assays and EMSA experiments. Quantitative analysis using the fluorescent spectroscopy was carried out to determine the binding affinity of the proteins.

Keywords

telomera, shelterin, TRF2, RAP1, T-smyčka, REST, pull-down assay, fluorescenční anizotropie, telomere, T-loop, fluorescent anisotropy

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 10. 6. 2019
• Supervisor: doc. Mgr. Ctirad Hofr, Ph.D.
• Reader: Mgr. Peter Kolesár, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Genomics and Proteomics