Strukturní charakterizace regulační domény lidské tyrosin hydroxylasy za použití NMR spektroskopie

Bc. Petr Louša

Diplomová práce

Structural characterization of the human regulatory domain of tyrosine hydroxylase by NMR spectroscopy

Anotace:

Tyrosinhydroxylasa je enzym, který katalyzuje hydroxylaci tyrosinu na L-3,4-dihydroxyfenylalanin (L-DOPA). Tato reakce je prvním a zároveň rychlost určujícím krokem z kaskády přeměn, vedoucích k důležitým neurotransmiterům - dopaminu, noradrenalinu a adrenalinu. Aktivita tohoto enzymu je modulována fosforylací regulační domény a interakcí s proteiny rodiny 14-3-3. V této diplomové práci se věnujeme charakterizaci regulační domény proteinu tyrosinhydroxylasy z hlediska spektroskopie nukleární magnetické rezonance (NMR). Hlavní výzvu při tomto procesu představuje dimerizace této domény a vnitřně neuspořádaný charakter přibližně 70 aminokyselin z jejího N-konce, zatímco zbylých přibližně 100 residuí je dobře uspořádaných. Prvním krokem při NMR studiu proteinu bylo přiřazení chemických posunů jednotlivým atomům. Pomocí neuniformně vzorkovaných spekter o vysoké dimenzionalitě (5D) bylo možné přiřadit téměř kompletní neuspořádanou oblast. Pro přiřazení strukturované oblasti jsme vyvinuli vlastní software, využívající trojrozměrnou strukturu molekuly a simulované žíhání. Provedli jsme též měření kinetických parametrů fosforylace residua S19 kinasou PRAK a studovali jsme vliv fosforylace S19 a S40 na chemické posuny jader amidických skupin. Fosforylovaný vzorek jsme poté titrovali vzorkem proteinu 14-3-3zeta a zkoumali jsme vliv interakce na intenzitu signálů v HN-HSQC spektrech.

Abstract:

Tyrosine hydroxylase is an enzyme catalysing the hydroxylation tyrosine to L-3,4-dihydroxyfenylalanine (L-DOPA). This reaction is the first and rate-limiting step in a biochemical pathway leading to important neurotransmitters - dopamine, noradrenaline and adrenaline. The activity of this enzyme is modulated by phosphorylation of its regulatory domain and by interaction with proteins of 14-3-3 family. In this diploma thesis we study the regulatory domain of tyrosine hydroxylase using nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). The main challenges arise from the dimeric nature of the regulatory domain, which contains both intrinsically disordered N-terminal (about 70 residues) and ordered (about 100 residues) region. The first step of NMR protein characterization is the assignment of chemical shifts for individual atoms. We managed to assign the disordered part almost completely using high-dimensional non-uniformly sampled spectra. For the assignment of structured part we developed our own software based on three-dimensional structure of protein and simulated annealing procedure. We measured also kinetic parameters of phosphorylation of serine-19 residue by PRAK kinase and we studied how the phosphorylation of S19 and S40 influences chemical shifts of amide groups. Subsequently, we used the doubly phosphorylated sample for titration with 14-3-3zeta protein and we observed the changes in HN-HSQC signal intensities to reveal which residues are influenced the most by this interaction.

Keywords

tyrosinhydroxylasa, NMR, fosforylace, neuniformní vzorkování, tyrosin hydroxylase, phosphorylation, non-uniform sampling

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 17. 5. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 16. 6. 2016
• Vedoucí: RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biomolekulární chemie